[發明專利]基于核酸適配體的高敏C反應蛋白納米免疫層析檢測方法

有效

• 申請號: 201911283287.2
• 申請日: 2019-12-13
• 公開（公告）號: CN111044729B
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 廉婷;任曼;陳程;姚楊;邱忠營;李慧瑾;張旭東
• 申請（專利權）人: 西安醫學院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/558
• 代理公司: 西安弘理專利事務所 61214
• 代理人: 曾慶喜

本發明公開了基于核酸適配體的高敏C反應蛋白納米免疫層析檢測方法，具體按照下述步驟進行：步驟1、根據是否與hsCRP結合選擇一對核酸適配體：核酸適配體A和核酸適配體B；步驟2、將步驟1得到的核酸適配體A進行標記并與修飾后的金納米微粒偶聯，得到AuNPs?Aptamer復合物。步驟3、將步驟1得到的核酸適配體B進行標記并與核酸適配體B與鏈霉親和素復合，得到核酸適配體B與鏈霉親和素的復合物；步驟4、將步驟2得到AuNPs?Aptamer復合物和步驟3得到的復合物噴涂到免疫層析試紙條上進行檢測；本發明為使用免疫層析試紙條法快速、高靈敏度檢測AMI相關蛋白標志物提供一種新的方法。

技術領域

本發明屬于子生物檢測技術領域，具體涉及基于核酸適配體的高敏C反應蛋白納米免疫層析檢測方法。

背景技術

急性心肌梗死(acute?myocardial?infarction，AMI)，也稱心肌梗死，因持久而嚴重的心肌缺血所致的急性心肌壞死。在美國心臟病協會(American?College?ofCardiology，ACC)和歐洲心臟病協會(European?Society?of?Cardiology，ESC)聯合發表的“心肌梗死指南”中，對AMI的診斷標準定義為：心肌標志物濃度的變化，同時還必須至少具備下列四條標準中的一項：(1)心肌缺血的病史、癥狀或體征；(2)心電圖示缺血的表現(ST-T段變化或者出現左束支傳導阻滯)；心電圖出現病理性波；(4)影像學證據表明新發室壁運動障礙或新發心肌壞死病灶。由此可見，心肌標志物憑借其特異性及敏感性，在AMI的早期診斷中具有舉足輕重的地位。檢測心臟相關生化標志物的含量，可以有效判斷心肌損傷程度，對AMI早期預警、急救過程中治療方案的選擇和疾病的預后均有十分重要的指導意義。

C反應蛋白(C-reactive?protein，CRP)是由肝臟合成的在Ca2+存在下能與肺炎鏈球菌C多糖體反應形成復合物的急性期反應蛋白。其正常血清含量低于10mg/ml，當機體遭受組織損傷或病毒侵染時，CRP的血漿濃度會迅速升高，因而在臨床上被廣泛用作炎癥的非特異性標志物。用于感染診斷的CRP臨界值多為5-10mg/L，最低檢出限(Limit?ofdetection,LOD)通常為2-5mg/L。但用于心血管病風險診斷時，需對CRP在0.5-3mg/L范圍內作分層評估，而該檢測范圍已低于常規CRP的最低檢出限。高敏C反應蛋白(highsensitivity?C-reactive?protein，hsCRP)通常指采用高敏感檢測技術能準確檢測的低劑量CRP，其最低檢出限可低于0.5mg/L。美國疾病控制與預防中心(CDC)和美國心臟學會(AHA)建議，可根據hsCRP水平對患者進行心血管病危險性分類，hsCRP1mg/L為低危險性，1.0-3.0mg/L為中度危險性，3.0mg/L為高度危險性。hsCRP被認為是反映冠狀動脈炎癥的生化標志物，由于AMI由易損斑塊引起，炎癥反應導致增高時，提示冠狀動脈粥樣斑塊出現破裂、出血以及血管閉塞。在的急性期，CRP的增高是由于冠狀動脈斑塊破裂在局部激活單核細胞及吞嗤細胞，后者釋放細胞因子等炎癥介質刺激肝臟迅速合成蛋白質而產生。研究發現，AMI患者hsCRP升高程度和梗死面積大小相關。在亞健康的年輕人當中，血漿hsCRP濃度越高，患心血管疾病的風險就越高。在AMI發生后12～24h測量hsCRP濃度，可以預測心衰和死亡的發生率。在AMI的早期，hsCRP的峰值濃度與早期機械并發癥(心臟破裂和室壁瘤等)相關。AMI發生后，hsCRP在2～4天達峰值，8～12周恢復到正常范圍。因此hsCRP的快速定量檢測對心肌梗死早期診斷具有重要意義。

傳統的CRP測定方法有酶聯吸附法、放射免疫法、乳膠凝集試驗和瓊脂擴散沉淀試驗等，以酶聯吸附法、放射免疫法較為敏感，正常值范圍為10mg/L。然而，近年來，越來越多的研究表明，低于傳統正常值的水平與心血管事件的發生和預后密切相關，因此需要采用靈敏度較高的免疫分析方法來測定。