[發明專利]一種納米抗體制備方法

在審

• 申請號: 201911282609.1
• 申請日: 2019-12-13
• 公開（公告）號: CN110964101A
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發明（設計）人: 趙冠華;靳昌忠
• 申請（專利權）人: 山東民康生物科技有限公司;杭州重鏈科技有限公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C12N5/0781;C12N5/10
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

本發明公開了一種納米抗體制備方法，通過將目的抗原免疫動物，獲得免疫后的動物外周血單個核細胞，并富集B細胞，用FITC熒光標記目的抗原，使用半固體培養基培養細胞，形成獨立單個B細胞克隆，挑選分泌陽性重鏈抗體的單個B細胞克隆，提取陽性B細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，并進行VHH片段擴增及測序，納米抗體的重組表達和活性鑒定。本發明的方法可以直接觀察并挑選分泌VHH抗體的陽性B細胞克隆，通過分泌的抗體形成熒光信號，更符合B細胞抗體分泌功能特性。本發明方法篩選制備的納米抗體具有分子量小、穩定性強、親和力高、可溶性好、容易表達等優勢，用途廣泛。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種納米抗體制備方法，可快速挑選和制備抗原特異性納米抗體。

背景技術

哺乳動物(包括人)的抗體一般由兩條重鏈與兩條輕鏈組成，重鏈的Fc區域能保證抗體在體內有較長的半衰期。傳統的抗體藥物具有一些不可避免的缺點：分子較大，難以穿透組織和細胞，尤其是血腦屏障等生理屏障；制備、保存和運輸過程中容易聚集、沉淀；容易引發抗抗體反應；篩選到具有生物活性的高親和力抗體幾率較低。1993年，比利時科學家Hamers-Casterman等在駱駝和羊駝體內發現一種新的抗體，這種抗體只有傳統抗體的1/10，卻完全具備了抗體活性，即能夠有效識別靶向抗原，并且此類抗體具有能夠穿透組織，到達病變位置的能力，而且這種抗體穩定性極佳，能夠耐受較強的溫度和酸堿性刺激，免疫原性低，親和力高，而且容易進行體外化學和生物學修飾，是良好的抗體藥物。這種抗體現在被稱為納米抗體(nanobody)，納米抗體同樣含有3個CDR，其中CDR3對親和力起到主要作用。與人抗體VH相比，CDR3更長，可以形成凸環結構，能夠深入抗原內部更好的結合抗原，因而親和力更高。此外，VHH的FR2的疏水殘基被親水殘基取代，水溶性更好，不易形成聚集體。所以，納米抗體的廣泛應用在生物醫藥領域將帶來一場巨大變革。

相較于普通抗體，納米抗體具有以下優勢：

1)針對不同種類的抗原，抗體制備的成功率較高，親和力可達到nM甚至pM級別；

2)通過基因工程進行抗體組合，不僅能夠提高親和力和特異性，而且能識別更多的抗原；

3)可與其他技術聯合做新型治療方法；

4)可用于不同的給藥方式，包括吸入、口服、滴眼等；

5)獨特的穩定性，包括熱穩定性和對酸堿的耐受性；

6)生產成本相對較低，可以采用原核培養(細菌或酵母)的生產體系，高濃度時不易聚集。

納米抗體具有廣闊的應用范圍。在藥物治療領域，Fc域的缺失使得納米抗體安全性得以提高，在作為純粹的免疫調節分子時，納米抗體的有效性也會提高。納米抗體的小分子量，使得其容易達到滲透到某些難以達到的癌變組織，分布均一性更好。在抗感染方面，納米抗體可以通過阻斷病毒-細胞結合、病毒進入、病毒包被等過程，防止病毒的擴散。血腦屏障是中樞神經系統疾病藥物開發的一個重大障礙，一些納米抗體可以穿透血藥屏障，使納米抗體在治療神經系統疾病具有獨特的潛力。此外，納米抗體在基礎研究領域、生物成像和生物學檢測等領域均具有獨特的應用價值。