[發(fā)明專(zhuān)利]一種納米抗體制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911282609.1
• 申請(qǐng)日: 2019-12-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110964101A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙冠華;靳昌忠
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山東民康生物科技有限公司;杭州重鏈科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K16/00
• 分類(lèi)號(hào): C07K16/00;C12N5/0781;C12N5/10
• 代理公司: 杭州求是專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

1.一種納米抗體制備方法，其特征在于，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：

(1)用目的抗原免疫動(dòng)物；

(2)獲得目的抗原免疫前和免疫后的動(dòng)物外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，并富集B細(xì)胞；

(3)用FITC熒光標(biāo)記抗原；

(4)使用CloneMedia^TM半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，形成獨(dú)立單個(gè)B細(xì)胞克隆；

(5)挑選分泌陽(yáng)性重鏈抗體的單個(gè)B細(xì)胞克隆；

(6)提取陽(yáng)性B細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行VHH片段擴(kuò)增及測(cè)序；

(7)納米抗體的重組表達(dá)；

(8)納米抗體抗目的抗原的活性鑒定，用ELISA方法鑒定純化的納米抗體活性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種納米抗體制備方法，其特征在于，步驟(1)將目的抗原與弗氏佐劑按照1：1比例混合后，按照6-7μg/kg劑量在動(dòng)物背部皮下多點(diǎn)注射方式免疫動(dòng)物，共免疫4次，每次間隔2周。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種納米抗體制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述目的抗原可以通過(guò)提取天然抗原獲得，或者通過(guò)同源重組的方式，由真核或原核細(xì)胞表達(dá)提純獲得，或者通過(guò)其它方式獲得。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種納米抗體制備方法，其特征在于，步驟(2)取免疫前動(dòng)物抗凝外周血10mL，通過(guò)密度梯度離心法分離PBMC，用CD138抗體包被的免疫磁珠從PBMC中分選B細(xì)胞，將B細(xì)胞置于細(xì)胞凍存液中，液氮保存?zhèn)溆茫媚康目乖庖邉?dòng)物，于免疫程序結(jié)束時(shí)取動(dòng)物抗凝外周血10mL，通過(guò)密度梯度離心法分離PBMC，并富集B細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種納米抗體制備方法，其特征在于，步驟(3)使用AlexaFluor^TM488Antibody Labeling Kit試劑盒對(duì)步驟(1)中目的抗原進(jìn)行綠色熒光標(biāo)記。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種納米抗體制備方法，其特征在于，所述步驟(4)向CloneMedia^TM半固體培養(yǎng)基添加步驟三所標(biāo)記的目的抗原0.1-10μg/L、PE標(biāo)記的抗動(dòng)物IgG輕鏈抗體、R848 2.5μg/mL和IL-2 1000U/mL，混勻，加入富集的B細(xì)胞，細(xì)胞密度1000個(gè)/mL，混勻后鋪6孔板，2mL/孔，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種納米抗體制備方法，其特征在于，所述步驟(5)將步驟(4)中培養(yǎng)的B細(xì)胞置于ClonePix^TM細(xì)胞單克隆挑選儀器中，對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行拍照，再用ClonePix^TMFL Fusion分析軟件分析單個(gè)B細(xì)胞克隆的平均熒光強(qiáng)度、克隆大小、克隆密集程度及克隆間距，挑選平均熒光強(qiáng)度強(qiáng)、克隆大小適中、相對(duì)獨(dú)立的單個(gè)B細(xì)胞克隆，置于96孔板中。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種納米抗體制備方法，其特征在于，所述步驟(6)用Qiangen^TMmiRNeasy Micro Kit提取步驟(5)中挑選的單個(gè)B細(xì)胞克隆總RNA，并使用Qiangen^TMOneStep RT-PCR Kit一步法擴(kuò)增VHH片段，所用上下游引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，將擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行基因測(cè)序。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種納米抗體制備方法，其特征在于，所述步驟(7)將表達(dá)載體pET30a(+)和VHH片段用Not I和Ned I酶雙酶切，跑膠后回收片段，將載體與片段連接，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并用1mmol/LIPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，進(jìn)行抗體親和層析純化，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>