[發(fā)明專利]產(chǎn)羊毛甾醇大腸桿菌菌株的構(gòu)建方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201911282159.6
• 申請日: 2019-12-13
• 公開（公告）號: CN110923183A
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宛雯
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇師范大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/61;C12N15/70;C12R1/19
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產(chǎn)羊毛甾醇大腸桿菌菌株的構(gòu)建方法，包括：根據(jù)大腸桿菌密碼子優(yōu)化莢膜甲氧球菌的鯊烯環(huán)氧酶的密碼子，PCR擴(kuò)增獲得鯊烯環(huán)氧酶基因片段；PCR擴(kuò)增獲得NADPH?細(xì)胞色素P450還原酶、鯊烯合成酶和羊毛甾醇合成酶基因片段并將其融合成為DNA片段SE?CPR?LS，將所述SE?CPR?LS片段通過酶切連接的方法克隆到載體pet21c上，構(gòu)建表達(dá)載體pet21c?SE?CPR?LS；將所述鯊烯合成酶基因片段通過同源重組的方法克隆到載體pACYCduet?1上，構(gòu)建表達(dá)載體pACYCduet?SS；將所述載體pet21c?SE?CPR?LS和pACYCduet?SS轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，得產(chǎn)羊毛甾醇大腸桿菌菌株。本發(fā)明通過外源質(zhì)粒導(dǎo)入方法改造大腸桿菌BL21(DE3)系統(tǒng)，使其能夠合成羊毛甾醇，并通過密碼子優(yōu)化技術(shù)提高了外源基因在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達(dá)量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)羊毛甾醇大腸桿菌菌株的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

羊毛甾醇別名異膽固醇，分子式為C₃₀H₅₀O。溶于乙醇、乙醚和氯仿；而在甲醇、丙酮中結(jié)晶。羊毛甾醇為無色粉末，具有很多重要的生物活性和廣泛的藥理作用，如降血壓、降血糖、抗癌、治療白內(nèi)障等。而且羊毛甾醇還是多種重要的甾醇類物質(zhì)生物合成的中間體，是化工、醫(yī)藥、食品行業(yè)的重要原料。

合成生物學(xué)的發(fā)展為利用快速生長的微生物來異源表達(dá)生物合成基因，提供了一種潛在的生產(chǎn)途徑。采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有很多優(yōu)勢，如：遺傳操作簡單、生長速度快，能在廉價培養(yǎng)基中高密度培養(yǎng)等。具報道(圖1)，法尼基焦磷酸(FPP)通過鯊烯合成酶(squalene synthase，SS)催化合成鯊烯(squalene)；而鯊烯通過鯊烯環(huán)氧酶(squaleneepoxidase,SE)在 NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶(NADPH-cytochrome P450reductase,CPR)的輔助作用下可以轉(zhuǎn)化為2,3環(huán)氧角鯊烯(2,3-oxidosqualene)；而2,3環(huán)氧角鯊烯在羊毛甾醇合成酶(Lanosterol synthase,LS)的進(jìn)一步催化作用下可以轉(zhuǎn)化為羊毛甾醇。通過將這些合成所需的異源基因在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)，就可以利用大腸桿菌胞內(nèi)已有的法尼基焦磷酸為底物，合成羊毛甾醇。目前，還沒有利用大腸桿菌進(jìn)行羊毛甾醇生物合成的報道。而構(gòu)建這樣一個合成系統(tǒng)，一方面可以直接利用大腸桿菌細(xì)胞合成羊毛甾醇，為羊毛甾醇的合成提供一個新的途徑；另一方面又可以以該系統(tǒng)為平臺細(xì)胞，進(jìn)行以羊毛甾醇為中間體的相關(guān)代謝路徑的開發(fā)和研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)羊毛甾醇大腸桿菌菌株的構(gòu)建方法。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下：

產(chǎn)羊毛甾醇大腸桿菌菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

S1：根據(jù)大腸桿菌密碼子優(yōu)化莢膜甲氧球菌的鯊烯環(huán)氧酶的密碼子，優(yōu)化后的序列如 SEQ ID NO.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個堿基形成的具有同等功能的核苷酸序列，以優(yōu)化合成的載體為模板，PCR擴(kuò)增獲得鯊烯環(huán)氧酶基因片段；

S2：以提取的釀酒酵母w303基因組為模板，PCR擴(kuò)增獲得NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶、鯊烯合成酶和羊毛甾醇合成酶基因片段；

S3：通過融合PCR的方法將鯊烯環(huán)氧酶、NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶和羊毛甾醇合成酶基因片段融合成為DNA片段SE-CPR-LS，并將所述SE-CPR-LS片段通過酶切連接的方法克隆到載體pet21c上，構(gòu)建表達(dá)載體pet21c-SE-CPR-LS；

S4：通過PCR擴(kuò)增的方法將鯊烯合成酶基因片段擴(kuò)增出來，并將所述鯊烯合成酶基因片段通過同源重組的方法克隆到載體pACYCduet-1上，構(gòu)建表達(dá)載體pACYCduet-SS；