[發(fā)明專利]產羊毛甾醇大腸桿菌菌株的構建方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201911282159.6 | 申請日： | 2019-12-13 |
| 公開（公告）號： | CN110923183A | 公開（公告）日： | 2020-03-27 |
| 發(fā)明（設計）人： | 宛雯 | 申請（專利權）人： | 江蘇師范大學 |
| 主分類號： | C12N1/21 | 分類號： | C12N1/21;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/61;C12N15/70;C12R1/19 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 221000 江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 羊毛 大腸桿菌 菌株 構建 方法 | ||
1.產羊毛甾醇大腸桿菌菌株的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
S1：根據大腸桿菌密碼子優(yōu)化莢膜甲氧球菌的鯊烯環(huán)氧酶的密碼子，優(yōu)化后的序列如SEQ ID NO.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個堿基形成的具有同等功能的核苷酸序列，以優(yōu)化合成的載體為模板，PCR擴增獲得鯊烯環(huán)氧酶基因片段；
S2：以提取的釀酒酵母w303基因組為模板，PCR擴增獲得NADPH-細胞色素P450還原酶、鯊烯合成酶和羊毛甾醇合成酶基因片段；
S3：通過融合PCR的方法將鯊烯環(huán)氧酶、NADPH-細胞色素P450還原酶和羊毛甾醇合成酶基因片段融合成為DNA片段SE-CPR-LS，并將所述SE-CPR-LS片段通過酶切連接的方法克隆到載體pet21c上，構建表達載體pet21c-SE-CPR-LS；
S4：通過PCR擴增的方法將鯊烯合成酶基因片段擴增出來，并將所述鯊烯合成酶基因片段通過同源重組的方法克隆到載體pACYCduet-1上，構建表達載體pACYCduet-SS；
S5：將所述載體pet21c-SE-CPR-LS和pACYCduet-SS通過化學轉化方法轉化進入大腸桿菌感受態(tài)細胞，得產羊毛甾醇大腸桿菌菌株。
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。
3.一種含鯊烯環(huán)氧酶、NADPH-細胞色素P450還原酶和羊毛甾醇合成酶基因片段的表達載體，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.13所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個堿基形成的具有同等功能的核苷酸序列。
4.一種含權利要求1中所述鯊烯合成酶基因片段的表達載體，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.14所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個堿基形成的具有同等功能的核苷酸序列。
5.含權利要求3中所述表達載體且含權利要求4中所述表達載體的工程菌。
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