[發明專利]PP2CG1基因在調控擬南芥耐低溫脅迫中的應用

在審

• 申請號: 201911277169.0
• 申請日: 2019-12-12
• 公開（公告）號: CN112980869A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 楊淑華;呂健;張曉燕
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/11;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發明涉及PP2CG1基因在調控擬南芥耐低溫脅迫中的應用。本發明首次揭示了PP2CG1基因具有調控擬南芥耐低溫脅迫的能力，將PP2CG1基因在擬南芥中敲除，得到的突變體植物相較野生型擬南芥表現出顯著的耐低溫表型。因此，PP2CG1基因與擬南芥抗低溫相關。本發明為培育耐低溫植物新品種提供了寶貴基因資源。本發明還提供了植物蛋白磷酸酶基因PP2CG1的CRISPR/Cas9突變體材料，敲除PP2CG1基因后，植物表現為耐低溫的表型。本發明的突變體材料為培育耐低溫脅迫植物提供了新的種質資源，同時為研究植物應答低溫脅迫的機制和抵御不利環境的分子機理奠定理論基礎。

技術領域

本發明涉及基因工程和植物遺傳育種領域，具體地說，涉及PP2CG1基因在調控擬南芥耐低溫脅迫中的應用。

背景技術

低溫寒害是一種全球性的自然災害，不僅限制植物的地理分布，還會抑制植物的生長發育，導致植物減產甚至死亡。因此，研究植物對低溫耐受性的分子機制，對培育抗寒穩產的糧食植物新品種具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是提供PP2CG1基因在調控擬南芥耐低溫脅迫中的應用。

本發明構思如下：利用模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)，通過CRISPR/Cas9技術將蛋白磷酸酶基因PP2CG1通過農桿菌介導的轉基因技術獲得敲除該基因的株系，隨后又將轉基因株系中的外源Cas9基因分離出植物體內得到非轉基因的pp2cg1-crispr擬南芥純合突變體株系。經過一系列低溫處理實驗驗證了該突變體植株耐受低溫的表型。

為了實現本發明目的，第一方面，本發明提供PP2CG1基因在調控擬南芥耐低溫脅迫中的應用。其中，所述調控為負調控。

本發明中，PP2CG1基因來源于哥倫比亞生態型的擬南芥，在擬南芥基因組數據庫中的編號為At2g33700。PP2CG1基因具有如SEQ ID NO:所示的核苷酸序列，由1585個堿基組成，PP2CG1基因的讀碼框為自5’端第1-184位、第272-464位、第615-819位和第1025-1582堿基組成的外顯子拼接組成。其編碼擬南芥PP2C蛋白磷酸酶。

PP2CG1基因為編碼如下蛋白磷酸酶(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

(b)SEQ ID NO:1所示序列經取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白質。

第二方面，本發明提供一種提高擬南芥耐冷性的方法，所述方法包括：利用基因工程手段，對擬南芥PP2CG1基因進行定點突變，使得該基因功能缺失，從而提高擬南芥的耐冷性；或者，

通過敲除或降低擬南芥PP2CG1基因的表達，從而提高擬南芥的耐冷性。

進一步地，針對擬南芥中的目標基因PP2CG1設計基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，將含有編碼所述sgRNA序列的DNA片段連接到攜帶CRISPR/Cas的載體中，轉化擬南芥，實現對擬南芥基因PP2CG1的定點突變，進而獲得該基因功能缺失的轉基因擬南芥植株。

優選地，sgRNA作用位點的核苷酸序列為5’-CACTGCTTGTGAGGTGCCT-3’和5’-CACAAGCAGTGCTACTAGG-3’(SEQ ID NO:9-10)。

將本發明的PP2CG1基因敲除后，植物表現為耐低溫的表型。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可以對所使用的載體進行改造，如加入植物可選擇性標記或具有抗性的抗生素標記物。

第三方面，本發明提供根據上述方法獲得的擬南芥在植物育種中的應用。

前述的應用，育種目的是選育耐低溫型植物。育種方法包括但不限于轉基因、雜交、回交、自交或無性繁殖。