[發明專利]一株分泌蛇形菌素單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用

有效

• 申請號: 201911272254.8
• 申請日: 2019-12-12
• 公開（公告）號: CN110724192B
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發明（設計）人: 匡華;金國浩;胥傳來;徐麗廣;馬偉;劉麗強;吳曉玲;宋珊珊;胡擁明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K16/14
• 分類號: C07K16/14;C12N5/20;C07K14/795;C07K1/107;G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

一株分泌蛇形菌素單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，屬于食品安全免疫檢測領域。本發明分泌蛇形菌素單克隆抗體的雜交瘤細胞株OVA15，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號CGMCC No.18515。利用該菌株分泌獲得的蛇形菌素單克隆抗體用于檢測食品中蛇形菌素殘留物。本發明獲得的蛇形菌素單克隆抗體，對蛇形菌素有較好的檢測靈敏度和特異性；其檢測限，即抑制率20%?80%對應的加標量為1.57–22.6ng/mL，IC₅₀值為5.97ng/mL；對蛇形菌素類似物交叉率小于1%。本發明還提供了一種全新的蛇形菌素完全抗原及其合成思路，采用該完全抗原篩選所獲得的蛇形菌素單克隆抗體細胞株可以用于免疫分析檢測。

技術領域

本發明涉及一株分泌蛇形菌素單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，屬于食品安全免疫檢測領域。

背景技術

蛇形菌素（Diacetoxyscirpenol，DAS）是由鐮刀菌產生的劇毒次生代謝產物，屬于A型單端孢霉烯族毒素，廣泛分布于自然界，嚴重危害人類和動物健康。蛇形菌素是全世界農業飼料和食品的天然污染物，通常存在于谷物中，尤其是小麥，玉米，大米中，臨床研究表明，它對不同動物物種具有很高的毒性。主要表現為厭食，嘔吐，生長抑制，神經毒性，免疫毒性，遺傳毒性和肝毒性。從人類和動物健康的角度來看，由A型單端孢霉烯族毒素能引起的厭食癥的潛在威脅尤其令人關注。

由于其嚴重危害人類和動物的健康，因此，高度敏感和特異性的蛇形菌素分析對于評估食品和動物飼料的安全性至關重要。

蛇形菌素的傳統檢測方法有氣質聯用法、毛細管電泳法、高效液相色譜法和毛細管電泳質譜聯用法等，然而這些方法的前處理比較復雜、費時，不適用于大量樣品的快速檢測，為了維護廣大消費者的利益，有必要建立一種針對蛇形菌素的高效、快速的檢測方法。

酶聯免疫法（ELISA）是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現場快速檢測，然而，使用酶聯免疫法檢測蛇形菌素的前提是得到對蛇形菌素具有高特異性和高靈敏度的單克隆抗體，因此，找到一種制備對蛇形菌素具有高特異性和高靈敏度的單克隆抗體的方法十分關鍵。

本發明嘗試通過雜交瘤細胞制備蛇形菌素單克隆抗體，但在制備能分泌蛇形菌素單克隆抗體的雜交瘤細胞株的過程中，如何制備蛇形菌素半抗原和蛇形菌素完全抗原、如何使小鼠產生強免疫，還需進一步的研究；制備出的雜交瘤細胞株是否能分泌出蛇形菌素單克隆抗體，還需要進一步驗證；分泌出的蛇形菌素單克隆抗體特異性、靈敏度如何，也需要進一步驗證。

發明內容

本發明的目的是克服上述不足之處，提供一株分泌蛇形菌素單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，此雜交瘤細胞株分泌的蛇形菌素單克隆抗體對蛇形菌素具有較好的特異性和檢測靈敏度（IC₅₀值為5.97ng/mL），可以用于建立蛇形菌素的免疫學檢測方法，檢測食品中蛇形菌素的殘留。

本發明的技術方案，一株分泌蛇形菌素單克隆抗體的雜交瘤細胞株OVA15，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，分類命名為單克隆細胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏編號CGMCC No.18515。

本發明提供了分泌蛇形菌素單克隆抗體的雜交瘤細胞株OVA15的制備方法，包含如下步驟：

（1）制備蛇形菌素半抗原及蛇形菌素完全抗原，將獲得的蛇形菌素完全抗原制備成含抗原弗氏佐劑與含抗原不完全弗氏佐劑；

（2）將得到的含抗原弗氏佐劑通過背部皮下注射，注射進入BALB/c小鼠體內進行多次免疫，首次免疫采用含抗原完全弗氏佐劑，加強免疫采用含抗原不完全弗氏佐劑；

（3）將第3次免疫過程結束后第7天的小鼠進行采血，通過間接ELISA檢測小鼠血清免疫效價和免疫抑制能力，篩選出血清中蛇形菌素抗體含量高的獲得免疫的小鼠；