[發(fā)明專利]過表達(dá)UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉(zhuǎn)移酶基因及其重組工程菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911263952.1
• 申請(qǐng)日: 2019-12-11
• 公開（公告）號(hào): CN111019958A
• 公開（公告）日: 2020-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾小群;孫潔;潘道東;夏超然;吳振;蔡振東;劉明學(xué);程璐
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/54
• 分類號(hào): C12N15/54;C12N15/74;C12N1/21;C12N1/04;C12R1/44;C12R1/01
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33226
• 代理人: 何仲

本發(fā)明公開了過表達(dá)UTP?葡萄糖?1?磷酸?尿苷轉(zhuǎn)移酶基因及其重組工程菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用，特點(diǎn)是該基因來自于嗜酸乳桿菌ATCC 4356編碼UTP?葡萄糖?1?磷酸?尿苷轉(zhuǎn)移酶的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示；構(gòu)建方法包括以下步驟：通過克隆嗜酸乳桿菌ATCC4356的UTP?葡萄糖?1?磷酸?尿苷轉(zhuǎn)移酶基因片段連接到pMG36e表達(dá)載體上，利用電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到肉葡萄球菌或者乳酸乳球菌中，通過紅霉素抗性篩選并鑒定獲得帶有目的基因的重組工程菌，即過表達(dá)UTP?葡萄糖?1?磷酸?尿苷轉(zhuǎn)移酶基因的工程菌，優(yōu)點(diǎn)是顯著提高菌體生長(zhǎng)、酶活性、凍干存活率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及過表達(dá)UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉(zhuǎn)移酶基因及其重組工程菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

肉葡萄球菌呈橢圓形或球形，無鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)，被分為凝血酶陽性或陰性葡萄球菌。其中金黃色葡萄球菌是凝固酶陽性葡萄球菌的原型物種，它是具有醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)重要性的病原體；凝血酶陰性葡萄球菌有肉葡萄球菌。與其他葡萄球菌相比，肉葡萄球菌不產(chǎn)生溶血素、毒素等，在葡萄球菌屬中被確認(rèn)為食品級(jí)菌株。肉葡萄球菌可以產(chǎn)生不同的酶，例如硝酸鹽還原酶，過氧化氫酶，超氧化物歧化酶，脂肪酶和蛋白酶，這些影響了發(fā)酵肉制品的肉色和風(fēng)味形成，具有護(hù)色增香的功能。所以肉葡萄球菌在肉制品風(fēng)味形成的加工中起著關(guān)鍵性的作用，因而該菌株常被作為發(fā)酵香腸的初始發(fā)酵劑的商業(yè)菌種廣泛應(yīng)用于肉制品發(fā)酵行業(yè)。

乳酸乳球菌是一種乳酸菌，是乳球菌屬中最為典型和最重要的菌株之一，一般呈形卵圓形或球形，為兼性厭氧菌。其生長(zhǎng)最佳生長(zhǎng)溫度為30℃，它們可以在10℃和45℃之間生長(zhǎng)。乳酸乳球菌安全性可靠已在酸奶、泡菜、乳酪、酸奶油、大豆酸奶等各種食品加工中得到了廣泛應(yīng)用。乳酸乳球菌已得到其全部基因組。在分子方面，乳酸乳球菌由于具有易操作、培養(yǎng)時(shí)間短、自身只分泌蛋白等特點(diǎn)被選擇作為克隆載體宿主菌的研究日益增多。

UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉(zhuǎn)移酶（UTP-glucose-1-phosphateuridylytransferase，）是糖代謝中一種重要的酶，在一定條件下它可以催化葡萄糖一磷酸和尿苷三磷酸的可逆反應(yīng)生成尿苷二磷酸葡萄糖和焦磷酸，其產(chǎn)物尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）是可以用作合成細(xì)胞外聚糖或脂多糖的前體，是生物體代謝途徑中的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物在物質(zhì)合成過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，參與蔗糖、纖維素、胼胝質(zhì)等的合成。而UDPG的主要來源是通過UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉(zhuǎn)移酶的催化下生成的，因此該酶催化的這一反應(yīng)將關(guān)系到下游的二糖或多糖的代謝。目前，通過過表達(dá)技術(shù)在植物中提高植物的生長(zhǎng)報(bào)道已經(jīng)很多，而將嗜酸乳桿菌編碼UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉(zhuǎn)移酶的基因在肉葡萄球菌或者乳酸乳球菌過表達(dá)，而影響肉葡萄球菌或乳酸乳球菌的生長(zhǎng)、酶活性及凍干存活率尚未見報(bào)道。因此，通過分子生物學(xué)技術(shù)改造菌株來提高肉葡萄球菌或乳酸乳球菌的生長(zhǎng)、酶活性及凍干存活率具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能顯著提高菌體生長(zhǎng)速率、酶活性和凍干存活率的過表達(dá)UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉(zhuǎn)移酶基因及其重組工程菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：

1、一種過表達(dá)UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉(zhuǎn)移酶基因（LBA1719），所述基因來自于嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus ）ATCC 4356編碼UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉(zhuǎn)移酶的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

2、過表達(dá)UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉(zhuǎn)移酶基因（LBA1719）的重組工程菌的構(gòu)建方法，具體步驟如下：

（1）重組表達(dá)載體pMG-LBA1719的構(gòu)建