[發明專利]過表達UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉移酶基因及其重組工程菌的構建方法和應用

在審

• 申請號: 201911263952.1
• 申請日: 2019-12-11
• 公開（公告）號: CN111019958A
• 公開（公告）日: 2020-04-17
• 發明（設計）人: 曾小群;孫潔;潘道東;夏超然;吳振;蔡振東;劉明學;程璐
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/74;C12N1/21;C12N1/04;C12R1/44;C12R1/01
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 何仲

1.一種過表達UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉移酶基因，其特征在于：所述基因來自于嗜酸乳桿菌（ Lactobacillus acidophilus）ATCC 4356編碼UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉移酶的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

2.一種過表達UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉移酶基因的重組工程菌的構建方法，其特征在于具體步驟如下：

（1）重組表達載體pMG-LBA1719的構建

以嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus ）ATCC 4356基因組DNA為模板，設計PCR引物，擴增UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉移酶基因LBA1719，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo：1所示；將表達載體pMG36e用限制性內切酶HindⅢ單酶切，并去磷酸化，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收后，將PCR擴增產物插入到表達載體pMG36e組成型啟動子P32下游多克隆位點，在50℃反應15min，構建重組表達載體pMG-LBA1719；

（2）重組工程菌的構建

將pMG-LBA1719過表達質粒經質粒小量提取試劑盒提取濃縮后電轉化導入至肉葡萄球菌或乳酸乳球菌中，37℃復蘇2h后，涂布紅霉素抗性平板，再在37℃培養36h，篩選轉化子；轉化子經PCR進行驗證，從而獲得過表達UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉移酶基因的工程菌。

3.根據權利要求2所述的過表達UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉移酶基因的重組工程菌的構建方法，其特征在于PCR引物的序列如下所示：LBA1719上游擴增引物：TCGACCTGCAGGCATGCAATGCACCATCATCACCATCATATGAAAGTAAGAAAAGCCATC；LBA1719下游擴增引物：GTTTTCAGACTTTGCAAGCTTTATTCCTTTTCAAGCTTCTT。

4.根據權利要求3所述的過表達UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉移酶基因的重組工程菌的構建方法，其特征在于PCR擴增程序如下：（1）94℃ 4min；（2）98℃ 10sec， 60℃ 5sec，72℃1min；重復30個循環；（3）72℃ 5min；PCR反應體系如下表所示：5×PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，20mM 正向引物1 μL，20mM 反向引物1 μL，模板DNA 2 μL，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 0.5 μL，用蒸餾水補足至 50μL。

5.根據權利要求4所述的過表達UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉移酶基因的重組工程菌的構建方法，其特征在于：步驟（1）中所述的PCR擴增產物和所述的表達載體pMG36e摩爾比為2∶1。

6.根據權利要求5所述的過表達UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉移酶基因的重組工程菌的構建方法，其特征在于所述的肉葡萄球菌電轉化具體步驟如下：

（1）肉葡萄球菌感受態的制備

將一環肉葡萄球菌接種至20mL LB培養基中，37℃過夜培養得到種子液；將5mL種子液接入100mL含0.5wt%葡萄糖和0.5wt%甘氨酸的LB培養基中，培養至OD=0.8；于3000rpm，離心10min，收集菌體，無菌水洗3次之后，用20mL預冷的A液洗滌細胞2次，于3000rpm，離心10min，收集菌體，即得到感受態嗜酸乳桿菌細胞；然后用預冷的0.5mL A液重懸，80μL分裝備用，再直接進行下一步實驗，或-80℃保存感受態細胞，其中所述的A液為含有10wt%甘油和10wt%蔗糖的超純水溶液；

（2）肉葡萄球菌的電轉

將感受態肉葡萄球菌細胞和1～5μg過表達質粒pMG-LBA1719轉移到冰冷的0.1cm間隙的電極杯中，以1.5kv，25μF，200 Ω，5.1ms脈沖轉化；然后迅速往電極杯中加入1mL預冷MRS培養基，于37℃復蘇2h，即感受態肉葡萄球菌導入過表達質粒pMG-LBA1719。