[發明專利]一種高穩定性、高亮度的Halo-tag探針及其合成方法與應用

有效

• 申請號: 201911257897.5
• 申請日: 2019-12-10
• 公開（公告）號: CN112939934B
• 公開（公告）日: 2022-11-15
• 發明（設計）人: 徐兆超;王光英;喬慶龍
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07D401/04
• 分類號: C07D401/04;C09K11/06;G01N21/64;A61K49/00
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

本發明提供了一類高穩定性、高亮度Halo?tag熒光探針及其合成方法與在雙光子熒光成像中的生物應用。該類探針以萘酰亞胺為熒光團，以氯代脂肪烴為識別基團，結構如式(1)所示。4位引入的氮雜環酮類取代基，使該Halo?tag探針能夠保持高的量子產率與穩定性。其中R為氮雜環酮類取代基，氮雜環包括四元氮雜環、五元氮雜環、六元氮雜環等。該類探針能夠對活細胞的Halo?tag蛋白標簽特異性標記，在雙光子熒光成像等領域有很好的應用前景。

技術領域

本發明屬于熒光探針標記領域，具體涉及一種高穩定性、高亮度的Halo-tag探針及其合成方法與應用。

背景技術

Halo-tag是由紫紅紅球菌的脫鹵素酶改造而成的蛋白標簽，能夠高親和力、高特異性地與連有不同功能基團的鹵代脂肪烴類探針共價結合。目的蛋白與Halo-tag蛋白標簽構成表達載體，可以保證遺傳標記的特異性；同時Halo-tag探針的多樣性能夠實現不同的研究目的(比如：活細胞熒光成像、蛋白質動力學分析、探測細胞氧化還原微擾及自噬的誘導等)。

Halo-tag探針主要由兩部分組成：一個是識別基團，一般為氯代己烷類衍生物；另一個是滿足不同研究需求的功能基團，如熒光素、香豆素、羅丹明等熒光染料。目前這類halo-tag探針通常存在膜透性差、背景熒光高、功能單一等問題。而雙光子熒光成像技術具有組織穿透性深、空間分辨率高、背景信號低等優勢，能夠彌補傳統halo-tag探針的不足。因此，Halo-tag探針設計與雙光子熒光成像技術的結合，必將成為生命過程研究中的強有力工具，開發高性能的Halo-tag雙光子熒光探針顯得尤為迫切。

發明內容

本發明提供了一類高穩定性、高亮度的Halo-tag探針，該探針能夠實現活細胞內的雙光子熒光成像。

本發明的另一目的是提供一種高穩定性、高亮度的Halo-tag探針的合成方法，該方法步驟簡單、原料低廉、產物易于分離等優點。

本發明的Halo-tag探針，通過在萘酰亞胺分子4位引入氮雜環酮類取代基，使得其適合應用于雙光子熒光成像。

本發明一類高亮度、高穩定性Halo-tag熒光探針，其結構式如下所示：

其中R為氮雜環酮類取代基，氮雜環包括四元氮雜環、五元氮雜環、六元氮雜環等。

該類探針結構式(1)具體為下列中的一種，

一類用于Halo-tag標記的熒光探針的合成方法，其合成路線如下，

具體合成步驟如下：

(1)中間體Halo-Br的合成

將4-溴-1,8-萘酐溶于乙醇中，而后向該反應液中加O-(6-氯己基)二甘醇胺。將反應液加熱至50-100℃，攪拌2-7h。冷卻降溫后，減壓除去溶劑，殘余物經硅膠柱分離(展開劑為石油醚：二氯甲烷＝10:1-2:1)得無色油狀產物Halo-Br。

步驟(1)中：4-溴-1,8-萘酐與O-(6-氯己基)二甘醇胺的質量比為1:0.7-1.5；4-溴-1,8-萘酐與無水乙醇的質量與體積比為1:20-60g/mL。

(2)熒光探針的合成

Halo-Br、氮雜環酮RH、Cs₂CO₃、G3-Xantphos(XantPhos Pd G3 95％)置于雙口瓶中并用氮氣置換3-4次。向反應體系中加入干燥的二氧六環，并加熱至70-140℃。2-7h后減壓除去溶劑，殘余物經硅膠柱分離得固體(熒光探針)。