[發明專利]一種大腸桿菌表達的重組豬α干擾素制劑中去除內毒素的方法

在審

• 申請號: 201911253876.6
• 申請日: 2019-12-09
• 公開（公告）號: CN113024656A
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 趙明;魏波;叢雁方;曲信芹;蔣皓靜;劉曉婧
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物制品有限公司;青島動保國家工程技術研究中心有限公司
• 主分類號: C07K14/56
• 分類號: C07K14/56;C07K19/00;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/34;C07K1/22
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明提供了一種大腸桿菌表達的重組豬α干擾素制劑中去除內毒素的方法,內毒素去除效果良好,重組豬α干擾素回收率高,可有效降低成本。所述方法包括以下步驟:(1)將含帶有組氨酸標簽重組豬α干擾素的菌體高壓勻漿充分破碎菌體；(2)加入1?5％尿囊素和20％的硫酸銨，4℃沉淀過夜,8000rpm 4℃離心棄沉淀；(3)將上清中加入10?100ppm多粘菌素B和50％的硫酸銨，4℃沉淀過夜；8000rpm 4℃離心棄上清，沉淀混懸后用金屬螯合層析進行純化收集洗脫液；(4)洗脫液經過超濾脫鹽即可得到去除內毒素的重組豬α干擾素。

技術領域

本發明涉及動物醫學領域基因工程重組蛋白質藥物的生產，尤其涉及一種大腸桿菌表達的重組豬α干擾素制劑中去除內毒素的方法。

背景技術

豬干擾素是研究最早的動物干擾素之一,是一類具有廣泛生物學活性的蛋白質,具有調節機體免疫功能、抗病毒、抗腫瘤等多種作用,是機體防御系統的重要組成部分,豬干擾素是治療豬病毒性疾病的首選藥物。20世紀80年代就有豬干擾素的相關報道。近年來,對豬干擾素的誘導條件和理化活性有了進一步的研究,同時對豬白細胞干擾素進行了大量的臨床試驗。研究表明,它對豬的許多病毒性傳染病如流行性腹瀉、豬瘟、傳染性胃腸炎等都具有顯著療效。本實驗室成功地用大腸桿菌表達系統表達出重組豬a干擾素基因,表達產物占菌體總蛋白的比率在20％-30％之間,表達產物具有抗病毒活性；并將實驗室合格產品制成凍干粉針劑發送至多家養豬場進行臨床試驗。結果證明,該室研制的重組豬a干擾素能有效治療豬病毒性疾病，為基因工程干擾素的規模化生產和應用提供了可能。

隨著分子生物學技術的發展,重組蛋白生物制品逐漸被開發利用。由于大多數重組蛋白質是利用大腸桿菌表達的,其屬于革蘭氏陰性菌,在純化蛋白時需要對菌體進行破壁,釋放重組蛋白的同時,脂多糖也隨之釋放到緩沖液中,造成內毒素污染。由于內毒素在強酸、強堿及高溫下都極其穩定,且性質極不均一,傳統的各種方法如萃取、吸附及層析等只能去除部分內毒素,達不到畜豬臨床應用的要求,很難找到一種有效的去除重組蛋白質溶液中內毒素的方法。目前報道的方法有TritonX-114霧點法,利用TritonX-114具有的兩性特點進行內毒素去除的方法,但是經過試驗發現這種方法也只能將內毒素的含量從1000萬EU/ml降低至10萬EU/ml左右,達不到臨床應用的標準。

現有的方法大多根據內毒素分子特性來破壞或去除內毒素，主要為超濾法、親和層析法、離子交換法或TritonX-114液相萃取法等，本研究結合純化大腸桿菌表達的重組豬α干擾素生產工藝，探索去除重組豬α干擾素溶液中內毒素的和適方案。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是基因工程表達重組豬α干擾素中去除內毒素的生產工藝問題。

有鑒于此,本發明是提出一種應用尿囊素、多粘菌素B、硫酸銨分級沉淀、親和層析和超濾技術聯用去除重組豬α干擾素溶液中內毒素的方法。通過在硫酸銨分級沉淀中先后添加尿囊素、多粘菌素B結合親和層析的方法初步去除內毒素；再用親和層析結合超濾脫鹽進行深度純化去除重組豬α干擾素溶液中內毒素的方法,可使內毒素含量降低至20EU/ml,最后的樣品稀釋分裝即可直接用于動物臨床使用，解決了內毒素含量達不到畜禽臨床應用標準的難題。

本發明涉及基因工程表達重組豬α干擾素中去除內毒素的方法,包括以下步驟:

(1)菌體破碎；將帶有組氨酸標簽重組豬α干擾素(本實驗室制備)的菌體用20mMTE(pH8.0)按照1:20的固液比混懸，4℃800-1000bar高壓勻漿三次充分破碎菌體，裂解液4℃8000rpm離心10min棄沉淀將上清蛋白液4℃保存備用。

(2)在硫酸銨分級沉淀中先后添加尿囊素、多粘菌素B結合親和層析初步去除內毒素的方法；

將(1)所得上清液中加入1-5％尿囊素和20％的硫酸銨(緩慢滴加4℃預冷的100％硫酸銨溶液)，4℃沉淀過夜后4℃8000rpm離心10min棄沉淀；