[發(fā)明專利]一種調(diào)控CAR-T特異性活化的啟動(dòng)子及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911236670.2
• 申請(qǐng)日: 2019-12-05
• 公開（公告）號(hào): CN112921034A
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張巍;陳軍;黃霞;齊亞男;趙永春;徐艷敏;趙文旭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶精準(zhǔn)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/62;C12N15/867;C12N5/10;C07K19/00;A61K39/00;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 北京元本知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11308
• 代理人: 黎昌莉

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)控CAR?T特異性活化的啟動(dòng)子及其應(yīng)用。所述啟動(dòng)子受缺氧環(huán)境調(diào)控，由Hif1a調(diào)節(jié)元件和迷你啟動(dòng)子連接構(gòu)成，所述Hif1α調(diào)節(jié)元件的重復(fù)數(shù)為4個(gè)，所述Hif1α調(diào)節(jié)元件的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。所述啟動(dòng)子能夠在缺氧環(huán)境強(qiáng)化目的基因表達(dá)并在缺氧環(huán)境中能夠加強(qiáng)CAR?T細(xì)胞的活化，提高CAR?T細(xì)胞針對(duì)腫瘤靶細(xì)胞的殺傷。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種啟動(dòng)子、一種CAR結(jié)構(gòu)、一種分離的核酸分子、一種表達(dá)載體和一種CAR-T細(xì)胞以及其在制備腫瘤藥物中的應(yīng)用和一種提高缺氧環(huán)境下CAR-T細(xì)胞殺傷能力的方法。

背景技術(shù)

CAR-T全稱是嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法，其在血液系統(tǒng)瘤中取得較好的成績(jī)，但CAR-T在實(shí)體瘤中的效果不如血液系統(tǒng)瘤，其原因一方面因?yàn)镃AR-T較難進(jìn)入實(shí)體瘤內(nèi)部，一方面即便CAR-T細(xì)胞進(jìn)入實(shí)體瘤內(nèi)部也因?yàn)槟[瘤微環(huán)境而不能正常發(fā)揮功能，這些都影響CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤治療的療效；并且由于實(shí)體瘤異質(zhì)程度高，實(shí)體瘤靶點(diǎn)往往在正常組織也有所表達(dá)，因此還存在脫靶風(fēng)險(xiǎn)等安全問(wèn)題。雖然目前有構(gòu)建第四代CAR、有構(gòu)建雙CAR(構(gòu)建帶有雙抗原的CAR-T)或帶有激活抑制功能的iCAR的結(jié)構(gòu)以期望提高實(shí)體瘤CAR-T治療的有效性和安全性，但這些CAR結(jié)構(gòu)仍存在安全性或較難被激活的問(wèn)題。因此，構(gòu)建一種在腫瘤微環(huán)境中特異啟動(dòng)活化的CAR結(jié)構(gòu)很有必要。

酸性和缺氧是腫瘤微環(huán)境中的兩大物理因素，實(shí)體瘤中的大部分的細(xì)胞都處在缺氧的環(huán)境中，而缺氧改變了腫瘤細(xì)胞的糖代謝途徑，產(chǎn)生大量的乳酸，造成腫瘤微環(huán)境中酸性的特征，而這些酸性可以降低腫瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，并且?guī)椭[瘤細(xì)胞的遷移。缺氧在實(shí)體瘤微環(huán)境研究比較清楚，如果可以設(shè)計(jì)在缺氧條件下被激活的可調(diào)控啟動(dòng)子，就可以達(dá)到在腫瘤微環(huán)境中特異性激活下游蛋白的表達(dá)從而提高CAR-T細(xì)胞的有效性和安全性的目的。

雖然關(guān)于腫瘤組織缺氧的理論研究較多，但如何應(yīng)用缺氧環(huán)境聯(lián)合CAR-T治療還是新的方向，需要全面的研究和嘗試。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種啟動(dòng)子，及包含所述啟動(dòng)子的CAR結(jié)構(gòu)、表達(dá)載體和CAR-T細(xì)胞。所述缺氧可調(diào)控的啟動(dòng)子能夠在缺氧環(huán)境強(qiáng)化目的基因表達(dá)，增強(qiáng)目的因子(蛋白、核酸等)的表達(dá)，提高抗腫瘤的藥物療效。

本發(fā)明從腫瘤自身的缺氧微環(huán)境出發(fā)，通過(guò)構(gòu)建缺氧激活的調(diào)控元件特異性調(diào)控蛋白的表達(dá)，調(diào)控CAR-T特異性活化，通過(guò)體外藥物構(gòu)建缺氧環(huán)境的成功以及后續(xù)的CAR-T殺傷的結(jié)果顯示在CoCl₂誘導(dǎo)的缺氧條件下的CAR-T比不誘導(dǎo)的CAR-T有更強(qiáng)的殺傷作用，同時(shí)說(shuō)明了所構(gòu)建的CAR結(jié)構(gòu)和CAR-T具有缺氧微環(huán)境被動(dòng)靶向性特征，在缺氧微環(huán)境中有更強(qiáng)活性和殺傷力，而在非缺氧微環(huán)境中則體現(xiàn)出了安全性特征。這對(duì)CAR-T的臨床應(yīng)用以及腫瘤聯(lián)合治療新策略的開發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下方案：

一種啟動(dòng)子，其特征在于，所述啟動(dòng)子由重復(fù)數(shù)為4的Hif1a調(diào)節(jié)元件和迷你啟動(dòng)子連接構(gòu)成，所述Hif1α調(diào)節(jié)元件核酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述啟動(dòng)子為4HRE-CMVmini promoter。

具體的，所述Hif1α調(diào)節(jié)元件為4個(gè)重復(fù)的串聯(lián)，所述串聯(lián)不僅指的是兩個(gè)核酸序列直接相連，即一個(gè)核酸序列的3’端和另一個(gè)核酸序列的5’端直接連接，還包括兩個(gè)核酸序列可以間接進(jìn)行連接，即在兩個(gè)核酸序列中間也可以連接有其他的核酸序列，只要不影響這兩個(gè)核酸序列功能的表達(dá)即可。

進(jìn)一步，所述啟動(dòng)子受缺氧環(huán)境調(diào)控，所述迷你啟動(dòng)子選自細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶的啟動(dòng)子、猿猴病毒40的啟動(dòng)子、腺病毒晚期啟動(dòng)子和合成啟動(dòng)子中的任一。

優(yōu)選的，迷你啟動(dòng)子選擇miniCMV。