[發明專利]一種可檢測SNP的新型LAMP方法、引物組和試劑盒

在審

• 申請號: 201911236437.4
• 申請日: 2019-12-05
• 公開（公告）號: CN110878368A
• 公開（公告）日: 2020-03-13
• 發明（設計）人: 張建民;溫俊平;廖明;張紅霞
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/42
• 代理公司: 佛山市禾才知識產權代理有限公司 44379
• 代理人: 資凱亮;劉穎

本發明公開了一種可檢測SNP的新型LAMP方法，包括以下步驟：(1)提取DNA為待檢測模板；(2)設計熒光基團修飾的環引物探針、內引物和外引物，環引物探針具有與DNA突變位點相結合的RNA堿基；(3)建立反應體系，將待檢測模板加入到反應體系中，檢測反應物是否產生熒光信號，若產生熒光信號則表示待檢測模板中具有目標DNA，若未產生熒光信號則表示待檢測模板中無目標DNA。相應的，本發明還公開了基于上述方法的用于檢測雞白痢沙門菌的引物組和試劑盒。本發明的檢測方法具有特異性強和靈敏度高的優點。

技術領域

本發明涉及基因檢測技術領域，尤其涉及一種可檢測SNP的新型LAMP方法、引物組和試劑盒。

背景技術

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP),主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，即DNA序列中單個堿基的差別。在自然界中，SNP具有數量多、分布廣和穩定遺傳等特點，與許多疾病直接相關。對于SNP的檢測分析在新藥研究、用藥探討、臨床檢驗和基因突變診斷等方面具有重要意義。

目前已有報道的SNP檢測技術包括高通量測序技術、毛細管電泳技術，流式熒光雜交、變性高效液相色譜檢測、等位基因特異寡核苷酸片段分析，焦磷酸測序技術、ARMS-技術和HRM技術等，這些方法在SNP檢測中要么檢測周期長、要么靈敏度低、要么特異性不夠強、要么成本高操作復雜，要么容易造成污染，因此亟需發明一種能更好地客服主流方法缺陷的SNP檢測方法。

環介導等溫擴增(LAMP)技術針對靶基因的多個區域設計多種特異引物，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst酶)，在恒溫條件下作用幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。與傳統分離鑒定相比，具有周期短、敏感性強，特異性高的優點。LAMP引物組一般由內引物FIP(F1c+F2)和BIP(B1c+B2)，外引物F3和B3以及環引物LoopF/LoopB組成。環引物是設計在F1c和F2之間或者B1c和B2之間的引物，其主要是在LAMP正常延伸反應啟動的前提下，起到大大提高等溫擴增效率的作用。然而，最初的LAMP技術僅能擴增一定的基因片段而無法實現對SNP的檢測。

雞白痢沙門菌(Salmonella Pullorum)屬于腸道桿菌科沙門氏菌屬的成員，其與雞傷寒沙門菌和腸炎沙門菌都屬于沙門菌D血清組。雞白痢沙門菌造成的雞白痢病是一種嚴重的系統性疾病，能垂直傳播，臨床癥狀是體重減輕，產卵減少和生殖能力受損，嚴重影響蛋雞生產，感染2～3周齡的小雞時造成很高的死亡率；雞傷寒沙門菌造成的禽傷寒病對任何年齡的禽類都有影響，主要在成年雞中觀察到，可垂直傳播，主要臨床癥狀是進食量突然減少，嗜睡，發燒，黃綠色腹瀉，很快死亡。腸炎沙門氏菌是引起急性胃腸炎的主要病原菌，感染后的典型癥狀包括發熱、腹瀉和嘔吐；在臨床生產中三者有時往往難以區分。

國務院提出2020年全國所有種雞場的雞白痢沙門菌病達到凈化標準，但目前部分場凈化效果還不太理想。雞白痢沙門菌的早期快速檢測鑒別是該病防控和凈化的基礎。傳統的分離鑒定方法周期長，經歷預增菌、選擇性增菌、生化鑒定、運動型檢查、血清學鑒定等流程。而玻片凝集試驗容易產生非特異性反應并且缺乏敏感性。因為雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌和雞腸炎沙門菌都屬于D血清群，具有非常相似的抗原表達式，在玻片凝集試驗中純粹依靠抗原表達式往往發生誤判。因此，在目前國內養殖場提倡凈化雞白痢的大環境下，發明一種效率高、特異性強、敏感性高的雞白痢沙門菌檢測方法具有重要的公共衛生學意義。

發明內容

本發明的目的在于提出一種可檢測SNP的新型LAMP方法，具有特異性強、敏感性高的特點。

本發明的目的在于提出基于一種可檢測SNP的新型LAMP方法用于檢測雞白痢沙門菌的引物組和試劑盒，具有準確快速檢測出雞白痢沙門菌的特點。

為達此目的，本發明采用以下技術方案：

一種可檢測SNP的新型LAMP方法，包括以下步驟：