[發明專利]一種可檢測SNP的新型LAMP方法、引物組和試劑盒

在審

• 申請號: 201911236437.4
• 申請日: 2019-12-05
• 公開（公告）號: CN110878368A
• 公開（公告）日: 2020-03-13
• 發明（設計）人: 張建民;溫俊平;廖明;張紅霞
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/42
• 代理公司: 佛山市禾才知識產權代理有限公司 44379
• 代理人: 資凱亮;劉穎

1.一種可檢測SNP的新型LAMP方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取DNA為待檢測模板；

(2)設計熒光基團修飾的環引物探針、內引物和外引物，所述環引物探針具有與DNA突變位點相結合的RNA堿基；

(3)建立反應體系，將待檢測模板加入到反應體系中，檢測反應物是否產生熒光信號，若產生熒光信號則表示待檢測模板中具有目標DNA，若未產生熒光信號則表示待檢測模板中無目標DNA。

2.根據權利要求1所述的可檢測SNP的新型LAMP方法，其特征在于，所述環引物探針由熒光基團和淬滅基團修飾；

所述反應體系中包含RnaseHⅡ酶，當環引物探針與DNA突變位點結合時，激活RnaseHⅡ酶發生切割，使熒光基團和淬滅基團分離。

3.根據權利要求1所述的可檢測SNP的新型LAMP方法，其特征在于，所述內引物為正向內側引物FIP和反向內側引物BIP；所述外引物為正向外側引物F3和反向外側引物B3。

4.根據權利要求1所述的可檢測SNP的新型LAMP方法，其特征在于，所述反應體系包括緩沖液、硫酸鎂、dNTP、Bst酶、RnaseHⅡ酶、環引物探針、內引物和外引物。

5.根據權利要求1所述的可檢測SNP的新型LAMP方法，其特征在于，所述反應體系的反應溫度為58℃-62℃。

6.基于權利要求1所述的可檢測SNP的新型LAMP方法用于檢測雞白痢沙門菌的引物組，其特征在于，包括：

正向外側引物F3的核苷酸序列：5′-AGGAACAATGAAGCTACCATA-3′；

反向外側引物B3的核苷酸序列：5′-GGCAGTGATGTTCCACAAT-3′；

正向內側引物FIP的核苷酸序列：

5′-GTCTTCCATAGCAAGCAATAGTGTTCACGACAGAAAATAATTGGATCG-3′；

反向內側引物BIP的核苷酸序列：

5′-ACCTGCAACAGCTTTAATAGAAAGGAATACTGCATCAAGTGATGAG-3′；

環引物探針的核苷酸序列：5′-CAGAGTATT(FAM)AGAG(RNA堿基)TCTAT-Eclipse-3′；

所述引物組針對雞白痢沙門菌rfbs基因。

7.基于權利要求1所述的可檢測SNP的新型LAMP方法檢測雞白痢沙門菌的試劑盒，其特征在于，包括反應液，所述反應液包括環引物探針、正向內側引物FIP、反向內側引物BIP、正向外側引物F3和反向外側引物B3；

所述正向外側引物F3的核苷酸序列：

5′-AGGAACAATGAAGCTACCATA-3′；

所述反向外側引物B3的核苷酸序列：

5′-GGCAGTGATGTTCCACAAT-3′；

所述正向內側引物FIP的核苷酸序列：

5′-GTCTTCCATAGCAAGCAATAGTGTTCACGACAGAAAATAATTGGATCG-3′；

所述反向內側引物BIP的核苷酸序列：

5′-ACCTGCAACAGCTTTAATAGAAAGCGAATACTGCATCAAGTGATGAG-3′；

所述環引物探針的核苷酸序列：5′-CAGAGTATT(FAM)AGAG(RNA堿基)TCTAT-Eclipse-3′；

所述引物組針對雞白痢沙門菌rfbs基因。

8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述反應液包括緩沖液2.5μl、硫酸鎂2.0μl、dNTP：2μl、Bst酶1.0μl、RnaseHⅡ酶0.1μl、環引物探針0.5μl、FIP+BIP 4μl和F3+B30.5μl。