[發(fā)明專利]一種可檢測SNP的新型CPA方法、引物組和試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911236426.6
• 申請日: 2019-12-05
• 公開（公告）號: CN110878367A
• 公開（公告）日: 2020-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張建民;溫俊平;廖明;張紅霞
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6858;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/42
• 代理公司: 佛山市禾才知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44379
• 代理人: 資凱亮;劉穎

本發(fā)明公開了一種可檢測SNP的新型CPA方法，包括以下步驟：(1)提取DNA為待檢測模板；(2)設(shè)計交叉引物組，交叉引物上設(shè)計與該DNA突變位點相結(jié)合的RNA堿基；(3)建立反應(yīng)體系，反應(yīng)體系中包含RnaseHⅡ酶，將待檢測模板加入到反應(yīng)體系中進行擴增，當交叉引物與DNA突變位點相結(jié)合時，激活RnaseHⅡ酶發(fā)生切割，使擴增反應(yīng)繼續(xù)進行，當交叉引物與DNA突變位點不能結(jié)合時，擴增反應(yīng)無法進行；(4)判斷反應(yīng)物中是否具有目標DNA。相應(yīng)的，本發(fā)明還公開了基于上述方法的用于檢測雞白痢沙門菌的引物組和試劑盒。本發(fā)明的檢測方法具有特異性強和靈敏度高的優(yōu)點。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種可檢測SNP的新型CPA方法、引物組和試劑盒

背景技術(shù)

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，即DNA序列中單個堿基的差別。在自然界中，SNP廣泛存在，對于SNP的檢測分析在藥物研制、臨床檢驗和基因突變診斷等方面具有重要意義。

目前主流的SNP檢測技術(shù)包括PCR-高通量測序技術(shù)、毛細管電泳技術(shù)，流式熒光雜交、變性高效液相色譜檢測、等位基因特異寡核苷酸片段分析，PCR-焦磷酸測序技術(shù)、ARMS-PCR技術(shù)和HRM技術(shù)等，這些方法在SNP檢測中或流程冗雜、或靈敏度低、或特異性差、或成本高，或易污染，因此亟需發(fā)明一種更好地檢測SNP的新方法。

交叉引物恒溫擴增(CPA)通過對靶基因設(shè)計五條特異性引物，在55～65℃恒溫下可對靶基因?qū)崿F(xiàn)指數(shù)級擴增，目前可用于疾病診斷和病原體的檢測。與環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)主要由兩條內(nèi)引物介導(dǎo)相比，CPA的循環(huán)擴增反應(yīng)主要在一條交叉引物介導(dǎo)下完成，然而兩者目前都只能用于擴增一定的基因片段而無法實現(xiàn)對SNP的檢測。

雞白痢病(PD)是由雞白痢沙門菌引起的系統(tǒng)性疾病，主要造成幼齡小雞死亡，母雞產(chǎn)蛋量下降，該病能垂直傳播，往往造成養(yǎng)殖場的重大損失。國務(wù)院提出2020年全國所有種雞場的雞白痢沙門菌病達到凈化標準，但目前部分場凈化效果還不太理想。雞白痢沙門菌的早期快速檢測鑒別是該病防控和凈化的基礎(chǔ)。雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌和腸炎沙門菌在臨床癥狀上往往相似難以分辨。傳統(tǒng)的分離鑒定方法流程冗長，如玻片凝集試驗容易發(fā)生非特異性反應(yīng)并且缺乏敏感性，因為三者都屬于D血清群，在抗原表達式上非常接近，純粹依據(jù)抗原式容易誤判，目前臨床用于特異性區(qū)分雞白痢沙門菌與其他不同血清型沙門菌的方法非常有限，在目前國內(nèi)養(yǎng)殖場提倡凈化雞白痢的大環(huán)境下，發(fā)明一種方便快速、敏感特異的雞白痢沙門菌檢測方法具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提出一種可檢測SNP的新型CPA方法，具有特異性強，敏感性高的特點。

本發(fā)明的目的在于提出一種基于上述方法檢測檢測雞白痢沙門菌的引物組和試劑盒，具有準確快速檢測出雞白痢沙門菌的特點。

為達此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種可檢測SNP的新型CPA方法，包括以下步驟：

(1)提取DNA為待檢測模板；

(2)設(shè)計交叉引物組，交叉引物上設(shè)計與該DNA突變位點相結(jié)合的RNA堿基；

(3)建立反應(yīng)體系，反應(yīng)體系中包含RnaseHⅡ酶，將待檢測模板加入到反應(yīng)體系中進行擴增，當交叉引物與DNA突變位點相結(jié)合時，激活RnaseHⅡ酶發(fā)生切割，使擴增反應(yīng)繼續(xù)進行，當交叉引物與DNA突變位點不能結(jié)合時，擴增反應(yīng)無法進行；

(4)判斷反應(yīng)物中是否具有目標DNA。

進一步的，步驟(4)中，以顯色法檢測反應(yīng)物中是否具有目標DNA。

進一步的，交叉引物組包括引物：LoopB、B3、F3、B2和BIP。