[發明專利]一種油菜BnFAD2基因高油酸等位突變及其SNP標記引物的開發和應用

有效

• 申請號: 201911212000.7
• 申請日: 2019-12-02
• 公開（公告）號: CN110760608B
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 傅鷹;張堯鋒;張冬青;余華勝;林寶剛
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 杭州恒翌專利代理事務所(特殊普通合伙) 33298
• 代理人: 王從友

1.控制甘藍型油菜種子油酸含量的BnFAD2基因其產生高油酸表型的突變基因，其特征在于，該突變基因為位于甘藍型油菜C05染色體的BnCFAD2a核苷酸序列1073處發生了G至A的置換，即：G1073A，突變基因命名為BnCfad2a，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所述。

2.權利要求1所述的突變基因BnCfad2a編碼的蛋白質，所述蛋白質的氨基酸序列如SEQID NO：4所述。

3.權利要求1所述的突變基因BnCfad2a的連鎖KASP分子標記，其特征在于，所述分子標記為分子標記KASP-1073；分子標記KASP-1073的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，為：

5’-tctgttctccacgatgccgcattatcacgcgatggaagctaccaaggcgataaagccgatactgggagagtattatcagttcgatgggacgccggtggttaaggcgatgtgga[g/a]ggaggcgaaggagtgtatctatgtggaaccggacaggcaaggtgagaagaaaggtgtgttctggtacaacaataagttatga-3’，且核酸序列自5’端起第114位堿基是SNP位點。

4.權利要求3所述的連鎖KASP分子標記用于確定生物樣本中突變基因BnCfad2a的存在中的應用。

5.權利要求3所述的連鎖KASP分子標記的PCR特異性擴增引物，其特征在于，分子標記KASP-1073的引物包括：

1）兩條特異性引物：

Primer_AlleleFAM：5’-ggtggttaaggcgatgtggag-3’，如SEQ ID NO.10所示；

Primer_AlleleHEX：5’-cggtggttaaggcgatgtggaa-3’，如SEQ ID NO.11所示；

2）一條通用引物：

Primer_Common：5’-ccggttccacatagatacactcctt-3’；如SEQ ID NO.12所示。

6.一種用于確定生物樣本中突變基因BnCfad2a存在的檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒至少包括權利要求5所述的PCR特異性擴增引物。

7.一種判斷目標生物樣本中產生高油酸表型的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

1）采用權利要求5所述的PCR特異性擴增引物和分子標記KASP-421的引物組對生物樣本的基因組DNA進行PCR擴增；分子標記KASP-421的引物組包括：

1）兩條特異性引物：

Primer_AlleleFAM：5’-gttggaatggtggcgtcgatg-3’，如SEQ ID NO.7所示；

Primer_AlleleHEX：5’-gtgttggaatggtggcgtcgata-3’，如SEQ ID NO.8所示；

2）一條通用引物：

Primer_Common：5’-ggacgacaccgtcggcctca-3’；如SEQ ID NO.9所示；

2）采用分子標記KASP-421引物組的判斷目標SNP的基因型：如果檢測到第+421位堿基只為T，則判定油菜樣品的BnAFAD2a為高油酸等位基因，基因型定義為AA，若只為堿基C，則判定該位點為中低油酸等位基因，基因型定義為aa，若檢測位點同時檢測到T和C，則判定為雜合體，基因型定義為Aa；所述的BnAfad2a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述；

采用分子標記KASP-1073引物組的判斷目標SNP的基因型：如果檢測到第+1073位堿基只為A，則判定油菜樣品的BnCFAD2a為高油酸等位基因，基因型定義為BB，若只為堿基G，則判定該位點為中低油酸等位基因，基因型定義為bb，若檢測位點同時檢測到A和G，則判定為雜合體，基因型定義為Bb；

3）將KASP-421和KASP-1073結果結合，若檢測樣品基因型同時含有兩個高油酸等位基因，基因型為AABB，則待測樣品為超高油酸單株或株系。