[發明專利]一種左旋多巴的生物合成方法

有效

• 申請號: 201911207728.0
• 申請日: 2019-11-30
• 公開（公告）號: CN110791536B
• 公開（公告）日: 2023-01-17
• 發明（設計）人: 于麗娟;馮怡;金大勇;曹加偉
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: C12P13/22
• 分類號: C12P13/22;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
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本發明公開了一種左旋多巴的生物合成方法，屬于生物工程技術領域。本發明構建了包含酪氨酸酚裂解酶基因dhtpl的重組表達載體pJJ?dhtpl，并實現了酪氨酸酚裂解酶在大腸桿菌BL21中的高效表達。利用表達有酪氨酸酚裂解酶的重組大腸桿菌靜息細胞，在16℃，pH 7.5?8.0，真空下可以將廉價的鄰苯二酚和丙酮酸銨一步催化合成左旋多巴。左旋多巴難溶于水，在該反應體系中以晶體形式析出，反應進行徹底，主要反應物鄰苯二酚的摩爾轉化率達96％以上。表達有酪氨酸酚裂解酶的重組大腸桿菌靜息細胞具有良好的催化穩定性，可以通過多次、分批添加鄰苯二酚和丙酮酸銨，不斷累積左旋多巴。本發明生產過程簡單，原材料易得，產物易分離純化，對于大規模工業化生產具有良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種左旋多巴的生物合成方法。

背景技術

左旋多巴(左多巴、L-DOPA、3-羥基-L-酪氨酸)，是用于治療帕金森氏病的重要化合物。目前左旋多巴的來源有植物提取法、化學合成法、生物合成法。(1)植物提取法。左旋多巴存在于許多天然植物中。1913年，生物化學家Guggenheim首次從蠶豆的莢膜中分離提取到左旋多巴。在此之后，在很多植物中均發現左旋多巴的存在，如貓豆、藜豆等(中國藥業，2008，17(24)：15-16)，其中貓豆是提取左旋多巴最主要的原料，左旋多巴質量分數高達6％～9％。BeheraAnindita等(Inventi Rapid PharmAnalysisQuality Assurance，2011(2)：135-146)通過提取技術的改良，貓豆中左旋多巴的提取得率已從1.5％提高到3.4％，純度達到99.9％。雖然從植物中直接分離提取左旋多巴是制備左旋多巴的傳統方法，但是受到原料來源少、提取步驟復雜繁瑣等因素的限制，導致其產量小、生產成本高，難以實現大規模生產，遠不能滿足市場需求。(2)化學合成法。目前，化學法主要通過不對稱合成法合成左旋多巴，工業化生產左旋多巴多以乙內酰脲與香草醛為原料，需經過8步反應合成，合成過程中需要大量金屬催化劑，反應條件苛刻，產物轉化率及對映體選擇性低，同時存在成本高、環境不友好等問題，在工業生產上受到限制。(3)生物合成法。生物合成法生產左旋多巴是最為吸引人的一個方法，目前主要通過酪氨酸酶、轉氨酶、氨基酰化酶以及酪氨酸酚裂解酶在一定條件下通過轉化底物生成左旋多巴。酪氨酸酶以酪氨酸作為底物，催化合成左旋多巴。酪氨酸酶是在許多細菌物種中發現的含銅雙氧激活酶，通常與黑色素的產生有關。這些蛋白質對酚和二酚底物有強烈的偏好，并且它們的反應范圍受到一定限制，總是產生活化的醌產物。因此，左旋多巴被兒茶酚酶活性依次氧化，并且不可避免地形成副產物DOPA醌，導致低轉化率。為了減少副產物并提高轉化率，需要額外添加還原劑，例如抗壞血酸，NH₃OH和NADH。然而，由于還原劑在生物催化期間不斷消耗，因此隨著時間的流逝，還原劑在間歇式反應器中含量不足，轉化率和生產率沒有得到大幅提高。此外，濃縮的抗壞血酸通常會抑制甲酚酶的活性，并使酪氨酸酶不可逆地失活。目前大多數研究使用商業化的蘑菇酪氨酸酶，但其與細菌相比存在不穩定性。Krishnaveni等(Curr Microbiol，2009，58(2)：122-128)利用Acremonium rutilum具有較高的酪氨酸酶生產能力的特性,轉化酪氨酸合成左旋多巴。該菌在經過優化的培養條件下連續培養120h，左旋多巴的最大產量僅為0.89g/L。轉氨酶可利用L-天冬氨酸或L-谷氨酸為底物，將L-天冬氨酸或L-谷氨酸中的氨基轉移到3，4二羥基苯丙酮酸上，進而生成左旋多巴。Nagasaki等(Agricultural andBiologicalChemistry，2014，39(2)：363-369)研究了Enterobacter cloacae NB320轉氨基反應合成左旋多巴的能力，其終產量為4mg/mL，轉化率為80％。由于轉氨酶法合成左旋多巴存在前體物質具有毒性、生產過程復雜及操作要求高等許多問題，隨后利用轉氨酶合成左旋多巴的相關研究比較少見。用于生產左旋多巴的氨基酰化酶大部分是從米曲霉中直接提取而來，提取過程繁瑣復雜，為了提高酶的穩定性和使用效率，工業上多使用固定化酶，1998年日本SANKYO公司建立了完整的氨基酰化酶催化合成左旋多巴的路線，并于2008年投產。我國新華制藥也用該法生產左旋多巴量約為300t。然而該方法酶提取復雜，合成步驟多，并且HBr的取代步驟會產生大量的臭氧層破壞物MeBr，環境污染嚴重。也有許多研究者利用酪氨酸酚裂解酶催化L-酪氨酸生成左旋多巴，但L-酪氨酸作為多巴的類似底物，對于產物的分離純化來說難度較大。