[發明專利]一種用油酸鈉誘導的胰島素抵抗H9c2細胞模型建立方法

在審

• 申請號: 201911206160.0
• 申請日: 2019-11-29
• 公開（公告）號: CN110804583A
• 公開（公告）日: 2020-02-18
• 發明（設計）人: 鄭曉珂;張奇;袁培培;傅陽;侯穎;高麗媛;魏亞新;馮衛生
• 申請（專利權）人: 河南中醫藥大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 蔡文雅

本發明涉及用油酸鈉誘導的胰島素抵抗H9c2細胞模型建立方法，可有效解決現有胰島素抵抗細胞模型建模困難，在采用高濃度葡萄糖誘導胰島素抵抗時，成模率較低，胰島素作為一種激素類物質，具有很大的不穩定性，非常不容易保存的問題，其解決的技術方案是，1）細胞培養；2）葡萄糖消耗實驗篩選油酸鈉工作濃度；3）In?cell Western；本發明選用油酸鈉對大鼠心肌細胞株進行誘導，并成功建立胰島素抵抗模型，首次證實油酸鈉可以誘導細胞胰島素抵抗，并明確了其誘發機制，開辟了油酸鈉的新用途，是采用油酸鈉誘導細胞胰島素抵抗模型建立方法上的創新。

技術領域

本發明涉及醫藥領域，特別是一種用油酸鈉誘導的胰島素抵抗H9c2細胞模型建立方法。

背景技術

胰島素抵抗是一種由于各種原因導致機體對生理水平的胰島素敏感性降低的病理狀態，可表現為空腹血糖升高，高胰島素血癥，血脂紊亂，高血壓等，是Ⅱ型糖尿病的發病基礎，也是代謝綜合征的核心。由胰島素抵抗引發的多種代謝性疾病，會增加患者發生心肌損傷的發病率和患病后的死亡率。尋找治療胰島素抵抗的活性化合物，并在細胞水平探明這些化合物的作用機制是當代研究人員的義不容辭的責任。

目前常用的胰島素抵抗細胞模型的建立方法包括棕櫚酸、葡萄糖、胰島素誘導法，但各種方法均具有一定的缺陷。棕櫚酸具有明顯的細胞毒性，這種毒性在200μmol/L的濃度下就開始逐漸顯現，而該濃度卻是誘導細胞胰島素抵抗的常用濃度，而且由于棕櫚酸是一種脂肪酸，所以它水溶性較差，又加大了建立模型時操作上的困難；由于葡萄糖是細胞生存的必須營養物質，這就決定了一些對營養物質需求較高的細胞例如心肌細胞，骨骼肌細胞等可能具有較高的葡萄糖耐受性，在采用高濃度葡萄糖誘導胰島素抵抗時，成模率較低；胰島素作為一種激素類物質，具有很大的不穩定性，非常不容易保存，所以尋找新的胰島素抵抗建模方法非常必要。

誘導胰島素抵抗發生的因素十分復雜，尚未完全確定，但可以明確的是胰島素抵抗均伴隨游離脂肪酸水平的升高，而過量油酸，棕櫚酸等的脂肪酸誘導又會造成胰島素抵抗。目前，采用油酸鈉誘導細胞胰島素抵抗模型的方法未見報道。

發明內容

針對上述情況，為解決現有技術之缺陷，本發明之目的就是提供一種用油酸鈉誘導的胰島素抵抗H9c2細胞模型建立方法，可有效解決現有胰島素抵抗細胞模型建模困難，在采用高濃度葡萄糖誘導胰島素抵抗時，成模率較低，胰島素作為一種激素類物質，具有很大的不穩定性，非常不容易保存的問題。

本發明解決的技術方案是，具體包括以下步驟：

1)細胞培養

H9c2使用添加3.70g/L NaHCO₃，3.6g/L Hepes，100U/mL青霉素和100g/mL鏈霉素為配方配制的DMEM(培養基)，添加10％胎牛血清后，在37℃，5％CO₂(V/V)，飽和濕度的CO₂培養箱中培養，待細胞長至70-80％處于對數生長期時進行實驗；

2)葡萄糖消耗實驗篩選油酸鈉工作濃度

分別設立空白培養基對照孔、正常(NC)組和油酸鈉濃度梯度組，H9c2細胞以5×10⁴個/mL的密度接種于96孔板中除空白培養基孔以外的實驗孔，次日待細胞貼壁后給予空白孔和NC組完全培養基；分別給予油酸鈉濃度梯度組含不同摩爾濃度油酸鈉的完全培養基，每組平行6個復孔，在CO₂培養箱中培養24h后檢測各孔培養基上清液中葡萄糖含量，每孔加入20μL5g/L的MTT溶液，再次培養4h后，檢測各個測量孔的OD值，各組葡萄糖消耗率＝(空白孔葡萄糖含量-測量孔葡萄糖含量)/OD值×100％；

3)In-cell Western