[發(fā)明專(zhuān)利]一種用油酸鈉誘導(dǎo)的胰島素抵抗H9c2細(xì)胞模型建立方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911206160.0
• 申請(qǐng)日: 2019-11-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110804583A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭曉珂;張奇;袁培培;傅陽(yáng);侯穎;高麗媛;魏亞新;馮衛(wèi)生
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 河南中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/077
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/077
• 代理公司: 鄭州天陽(yáng)專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 41113
• 代理人: 蔡文雅

1.一種用油酸鈉誘導(dǎo)的胰島素抵抗H9c2細(xì)胞模型建立方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)細(xì)胞培養(yǎng)

H9c2使用添加3.70g/L NaHCO₃，3.6g/L Hepes，100U/mL青霉素和100g/mL鏈霉素為配方配制的DMEM，添加10％胎牛血清后，在37℃，5％CO₂，飽和濕度的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70-80％處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；

2)葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)篩選油酸鈉工作濃度

分別設(shè)立空白培養(yǎng)基對(duì)照孔、正常組和油酸鈉濃度梯度組，H9c2細(xì)胞以5×10⁴個(gè)/mL的密度接種于96孔板中除空白培養(yǎng)基孔以外的實(shí)驗(yàn)孔，次日待細(xì)胞貼壁后給予空白孔和NC組完全培養(yǎng)基；分別給予油酸鈉濃度梯度組含不同摩爾濃度油酸鈉的完全培養(yǎng)基，每組平行6個(gè)復(fù)孔，在CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后檢測(cè)各孔培養(yǎng)基上清液中葡萄糖含量，每孔加入20μL5g/L的MTT溶液，再次培養(yǎng)4h后，檢測(cè)各個(gè)測(cè)量孔的OD值，各組葡萄糖消耗率＝(空白孔葡萄糖含量-測(cè)量孔葡萄糖含量)/OD值×100％；

3)In-cell Western

設(shè)立NC和SO組，每個(gè)蛋白設(shè)立三個(gè)復(fù)孔，以5×10⁴個(gè)/mL的密度接種H9c2于避光的96孔板中，給予NC組完全培養(yǎng)基，SO組含不同摩爾濃度油酸鈉的完全培養(yǎng)基，藥物干預(yù)24h后，棄去培養(yǎng)基，以3.7％甲醛固定細(xì)胞20min，0.1％Triton透化5次/5min，5％脫脂奶粉封閉1.5h，加入以封閉液稀釋的待測(cè)抗原的特異性抗體，包括GLUT4、p-IRS-1、IRS-1、β-tubulin，在4℃孵育18h后，以含有0.02％Tween20的磷酸鹽緩沖溶液洗滌除去未結(jié)合抗體，以相應(yīng)熒光二抗避光孵育1h后，再次洗滌除去未結(jié)合二抗，在Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)下掃描成像并量化數(shù)據(jù)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用油酸鈉誘導(dǎo)的胰島素抵抗H9c2細(xì)胞模型建立方法，其特征在于，所述的步驟2)中油酸鈉最佳濃度為100-250μmol/L。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用油酸鈉誘導(dǎo)的胰島素抵抗H9c2細(xì)胞模型建立方法，其特征在于，所述的步驟3)中油酸鈉最佳濃度為150μmol/L。