[發明專利]一種同時檢測多種病原微生物的引物探針組合、試劑盒以及方法

在審

• 申請號: 201911200522.5
• 申請日: 2019-11-29
• 公開（公告）號: CN110904272A
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發明（設計）人: 王艷;莊裕華
• 申請（專利權）人: 上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 余永莉

1.一種同時檢測多種病原微生物的引物探針組合，其特征在于，該引物探針組合包括：

用于檢測呼腸孤病毒的如SEQ ID NO：1-2所示的特異性引物對，如SEQ ID NO：3所示的特異性探針；

用于檢測牛細小病毒的如SEQ ID NO：4-5所示的特異性引物對，如SEQ ID NO：6所示的特異性探針；

用于檢測藍舌病毒的如SEQ ID NO：7-8所示的特異性引物對，如SEQ ID NO：9所示的特異性探針；

用于檢測牛腹瀉病毒的如SEQ ID NO：10-11所示的特異性引物對，如SEQ ID NO：12所示的特異性探針；

用于檢測牛多瘤病毒的如SEQ ID NO：13-14所示的特異性引物對，如SEQ ID NO：15所示的特異性探針；以及

用于檢測狂犬病毒的如SEQ ID NO：16-17所示的特異性引物對，如SEQ ID NO：18所示的特異性探針。

2.根據權利要求1所述的同時檢測多種病原微生物的引物探針組合，其特征在于，所述特異性探針的5’端修飾的活性有機基團為氨基。

3.根據權利要求1所述的同時檢測多種病原微生物的引物探針組合，其特征在于，所述特異性引物中的SEQ ID NO：1，5，7，10，13，16的5’端修飾有生物素標記。

4.一種同時檢測多種病原微生物的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1-3中任意一項所述的同時檢測多種病原微生物的引物探針組合。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，其中12條特異性引物的摩爾濃度比值為：SEQ ID NO.1﹕SEQ ID NO.2﹕SEQ ID NO.4﹕SEQ ID NO.5﹕SEQ ID NO.7﹕SEQ ID NO.8﹕SEQ ID NO.10﹕SEQ ID NO.11﹕SEQ ID NO.13﹕SEQ ID NO.14﹕SEQ ID NO.16﹕SEQ ID NO.17＝1.5﹕1.5﹕2.0﹕2.0﹕3.0﹕3.0﹕2.0﹕2.0﹕1.5﹕1.5﹕2.0﹕2.0。

6.一種液相芯片技術檢測微生物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1，根據呼腸孤病毒、牛細小病毒、藍舌病毒、牛腹瀉病毒、牛多瘤病毒、狂犬病毒的基因序列分別設計合成對應的具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的呼腸孤病毒探針、具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的牛細小病毒探針、具有如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列的藍舌病毒探針、具有如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列的牛腹瀉病毒探針、具有如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列的牛多瘤病毒探針和具有如SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列的狂犬病毒探針；

S2，將呼腸孤病毒探針、牛細小病毒探針、藍舌病毒探針、牛腹瀉病毒探針、牛多瘤病毒探針、狂犬病毒探針分別與第一、第二、第三、第四、第五和第六熒光編碼微球相連，分別獲得第一、第二、第三、第四、第五和第六偶聯微球的探針溶液；

S3，將呼腸孤病毒、牛細小病毒、藍舌病毒、牛腹瀉病毒、牛多瘤病毒、狂犬病毒陰性樣品，經DNA抽提和PCR擴增獲得PCR產物，將第一、第二、第三、第四、第五和第六偶聯微球的探針溶液混合形成混合偶聯微球的探針溶液，然后將PCR產物加入混合偶聯微球的探針溶液，在Luminex儀器中讀取信號，根據該信號確定閾值；

S4，將待測樣品，經DNA抽提和PCR擴增獲得待測PCR產物，將待測PCR產物加入混合偶聯微球的探針溶液，在Luminex儀器中讀取信號，與閾值比較，判斷待測樣品為陰性或陽性。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述呼腸孤病毒探針、牛細小病毒探針、藍舌病毒探針、牛腹瀉病毒探針、牛多瘤病毒探針、狂犬病毒探針的Tm值保持在56℃-58℃。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，獲得待測PCR產物具體方法包括如下步驟：

P1，提供用于檢測呼腸孤病毒的SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列的特異性引物對，用于檢測牛細小病毒的SEQ ID NO：4-5所示的核苷酸序列的特異性引物對，用于檢測藍舌病毒的SEQ ID NO：7-8所示的核苷酸序列的特異性引物對，用于檢測牛腹瀉病毒的SEQ IDNO：10-11所示的核苷酸序列的特異性引物對，用于檢測牛多瘤病毒的SEQ ID NO：13-14所示的核苷酸序列的特異性引物對，以及用于檢測狂犬病毒的SEQ ID NO：16-17所示的核苷酸序列的特異性引物對，其中，所述特異性引物中的SEQ ID NO：1，5，7，10，13，16的5’端修飾有生物素標記；以及

P2，利用所述特異性引物對擴增，分別獲得呼腸孤病毒目的基因、牛細小病毒目的基因、藍舌病毒目的基因、牛腹瀉病毒目的基因、牛多瘤病毒目的基因、狂犬病毒目的基因及包含呼腸孤病毒目的基因、牛細小病毒目的基因、藍舌病毒目的基因、牛腹瀉病毒目的基因、牛多瘤病毒目的基因、狂犬病毒目的基因的多重PCR產物。