[發明專利]人H組輪狀病毒的培養和免疫熒光定量檢測方法

在審

• 申請號: 201911199116.1
• 申請日: 2019-11-29
• 公開（公告）號: CN112877298A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 段招軍;龐立麗;章青
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;G01N33/569;C12R1/93
• 代理公司: 北京元中知識產權代理有限責任公司 11223
• 代理人: 王明霞

本發明公開了一種人H組輪狀病毒的培養和免疫熒光定量檢測方法，包括：(1)人H組輪狀病毒感染傳代細胞，進行傳代擴大培養；(2)制備包含至少部分VP6基因序列和/或至少部分VP8基因序列的表達載體，在原核表達系統中大量表達相應蛋白并進行純化；(3)用純化的蛋白制備抗體并作為檢測抗體，利用免疫熒光檢測方法檢測人H組輪狀病毒。該方法特異性高，周期短，誤差小，重復性好。本方法可以直觀地觀察病毒感染細胞的情況，對病毒的生物學特征進行研究，并且可以對病毒定量提供有利的手段。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體地說，涉及人H組輪狀病毒的培養和免疫熒光定量檢測方法。

背景技術

輪狀病毒(Rotavirus，RV)是世界范圍內5歲以下兒童嚴重急性腹瀉的主要原因。在低收入國家與高收入國家中，1歲以下嬰幼兒感染人數分別占總人數的80％及65％，據WHO估計世界范圍內每年大約有42～49.4萬嬰幼兒由于感染RV而死亡，因輪狀病毒感染導致住院的腹瀉患兒就已超過200萬。被感染患者中大多數死亡病例發生在亞洲和非洲，在這些發展中國家，死亡率的增加可能與落后的衛生醫療水平、營養不良及其他疾病并存等因素有關。據統計，在中國，每年大約有4萬嬰幼兒死于輪狀病毒感染，有1320萬例輪狀病毒腹瀉發生，其中兒科患者就已達22萬例；發達國家每年由于RV感染導致腹瀉住院的人數也非常多，由此可見，RV感染無論在發展中國家還是發達國家都是一個非常重要的健康和公共衛生問題。

RV是呼腸孤病毒科輪狀病毒屬的成員，該病毒在電鏡下觀察呈車輪狀形狀所以被命名為輪狀病毒。輪狀病毒是由三層衣殼蛋白包被核心基因組組成的無包膜二十面體結構，其顆粒直徑在70～75nm之間，核心基因組由不連續的11個雙鏈RNA節段構成，分別編碼六種結構蛋白(VP1～VP4，VP6和VP7)和六種非結構蛋白(NSP1～NSP6)。目前輪狀病毒的分子特性及疫苗研發主要集中在對結構蛋白VP4、VP6、VP7和非結構蛋白NSP4的研究，其中VP4和VP7兩個外層衣殼蛋白因其與抗原性相關而被作為輪狀病毒血清型G型和P型的分型依據。依據中層結構蛋白VP6的抗原性不同將輪狀病毒分為A到J十個組。非結構蛋白NSP4由第10基因片段編碼，因其與病毒的致病性相關，通常作為病毒的腸毒素發揮作用，是引起腹瀉的重要致病因素。VP6蛋白是輪狀病毒中含量最豐富的蛋白，大約占病毒總蛋白量的51％。在輪狀病毒中該蛋白由第6基因片段編碼，分子量大約為45KDa。VP6在病毒三層衣殼中位于中間層，是衣殼中間層的主要結構蛋白，約含有397個氨基酸，它在病毒進入細胞和基因包裝之間起到一個物理受體的作用。同時，VP6具有組和亞組抗原特異性，是病毒的組抗原和亞組抗原蛋白，能刺激機體產生相應抗體。

目前已鑒定出9組輪狀病毒(從輪狀病毒A到輪狀病毒I)，第10組輪狀病毒RVJ也已經有報道。其中A、B、C及H組能感染人和動物；而D～G組和I、J組則僅在動物中發現。曾經在豬、人和蝙蝠中檢測到H組輪狀病毒。近些年來，多個國家報道豬H組輪狀病毒。目前為止，文獻報道的人H組輪狀病毒只分離出了兩株，分別是在中國分離到的J19株和從印度分離到的B219株。H組輪狀病毒的核酸電泳圖型和血清學分析與早先發現引起成人腹瀉的輪狀病毒截然不同，因而稱為新成人輪狀病毒，關于H組輪狀病毒的報道還很少。