[發明專利]人H組輪狀病毒的培養和免疫熒光定量檢測方法

在審

• 申請號: 201911199116.1
• 申請日: 2019-11-29
• 公開（公告）號: CN112877298A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 段招軍;龐立麗;章青
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;G01N33/569;C12R1/93
• 代理公司: 北京元中知識產權代理有限責任公司 11223
• 代理人: 王明霞

1.一種人H組輪狀病毒的培養和免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，包括：

(1)人H組輪狀病毒感染傳代細胞，進行傳代擴大培養；

(2)制備包含至少部分VP6基因序列和/或至少部分VP8基因序列的表達載體，在原核表達系統中大量表達相應蛋白并進行純化；

(3)用純化的蛋白制備抗體并作為檢測抗體，利用免疫熒光檢測方法檢測人H組輪狀病毒。

2.根據權利要求1所述的人H組輪狀病毒的培養和免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，步驟(1)中，將凍存的人H組輪狀病毒解凍融化，加入10ug/ml不含EDTA的胰蛋白酶活化病毒，37℃孵育；

優選的，所述的人H組輪狀病毒為J19毒株。

3.根據權利要求1或2所述的人H組輪狀病毒的培養和免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，步驟(1)中，被活化的人H組輪狀病毒感染傳代細胞后，添加含10ug/ml胰蛋白酶的細胞培養液，37℃孵育進行擴大培養；

優選的，所述傳代細胞包括MA104細胞、Caco-2細胞、Hela細胞、293T細胞、Vero細胞、HT29細胞、BHK-T7細胞、Rd細胞、Hep-2細胞；

優選的，所述傳代細胞為MA104細胞。

4.根據權利要求1-3任意一項所述的人H組輪狀病毒的培養和免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，步驟(2)中，將所述表達載體轉入大腸桿菌中，篩選重組單克隆，并將重組單克隆接種至液體培養基中，37℃震蕩培養，向菌液中加入誘導劑，22℃震蕩培養，進行小量誘導表達；

優選的，所述表達載體中包含VP6基因的全長序列。

5.根據權利要求4所述的人H組輪狀病毒的培養和免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，將小量表達時蛋白產量高的菌株進行活化，接種至液體培養基中，37℃震蕩培養，轉接兩次后，取菌液加入誘導劑，22℃震蕩培養，進行大量誘導表達；

優選的，所述誘導劑為IPTG。

6.根據權利要求1-5任意一項所述的人H組輪狀病毒的培養和免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，將大量誘導表達獲得的菌液離心、棄上清，加入PBS緩沖液重懸，在冰浴條件下超聲，超聲后的裂解液離心，取含有帶His標簽的VP6蛋白和/或VP8蛋白的上清液備用；

優選的，超聲條件為：超聲功率80％，超聲4s間隔7s，工作總時長為70min。

7.根據權利要求6所述的人H組輪狀病毒的培養和免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，將含有帶His標簽的VP6和/或VP8蛋白上清液進行親和層析純化，獲得洗脫液，再進行蛋白分子篩純化，獲得純化濃縮后的VP6-His蛋白和/或VP8-His蛋白，VP6-His蛋白和/或VP8-His蛋白濃度至少達到20mg/mL。

8.根據權利要求1-7任意一項所述的人H組輪狀病毒的培養和免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，免疫熒光檢測方法的步驟具體包括：

①培養傳代細胞；

②將凍存的人H組輪狀病毒毒株在室溫下解凍融化，加入10ug/ml不含EDTA的胰蛋白酶激活病毒，培養；

③向細胞中加入已激活的人H組輪狀病毒，吸附；

④加入含10ug/mL胰蛋白酶的培養液，培養；

⑤加入冰甲醇固定細胞；

⑥用0.5％triton X-100對細胞透化處理；

⑦5％BSA常溫封閉；

⑧加入一抗anti-VP6抗體和/或anti-VP8抗體，4℃過夜；

⑨加入二抗熒光素FITC標記的山羊抗兔IgG，室溫避光孵育；

⑩加入0.5ug/mLDAPI染色，清洗，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察以及計數熒光病灶數。

9.根據權利要求8所述的人H組輪狀病毒的培養和免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，步驟⑨中加入一抗anti-VP6抗體和/或anti-VP8抗體，抗體稀釋液為1％BAS，以1:1000比例稀釋。

10.根據權利要求8所述的人H組輪狀病毒的培養和免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，步驟⑩中加入二抗熒光素FITC標記的山羊抗兔IgG，抗體稀釋液為1％BAS，以1:1000比例稀釋，室溫避光孵育45min。