[發明專利]鑒定粉擬青霉的特異性引物、試劑盒、方法及其應用

在審

• 申請號: 201911197113.4
• 申請日: 2019-11-29
• 公開（公告）號: CN112877452A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 錢正明;謝美霞;鄭雅丹;李春紅;李文慶;金李玲
• 申請（專利權）人: 東莞市東陽光冬蟲夏草研發有限公司;宜昌山城水都冬蟲夏草有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/79
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種鑒定粉擬青霉的特異性引物、試劑盒、方法及其應用。本發明適用于檢測或輔助檢測待測樣品是否含有粉擬青霉，鑒定或輔助鑒定待測樣品是否為粉擬青霉。本發明提供的特異性引物對通過PCR技術可以快速、準確、靈敏地實現上述應用，且引物特異性強，準確度高，擴增效果好，重復性好，耐受性好，適宜推廣應用，能鑒別粉擬青霉與其他品種的擬青霉，也能用于屬間鑒別。

技術領域

本發明生物學技術領域，具體涉及鑒別粉擬青霉菌的特異性引物、試劑盒、方法及其應用。本發明技術適用于檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有粉擬青霉菌；鑒定或輔助鑒定待測樣品是否為粉擬青霉菌。

背景技術

粉擬青霉是擬青霉屬中一種寄主范圍廣泛的蟲生真菌(拉丁名：Paecilomycesfarinosus)，可侵入鱗翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目等多種昆蟲，在適宜的條件下，粉擬青霉分生孢子發育出牙管，進入蟲體內，吸取蟲體內的水分和養分，生長、伸長為菌絲，菌絲不斷分枝、增殖，侵入蟲體內各個器官，直到整個蟲體內充滿菌絲，使蟲體內生理代謝混亂或代謝障礙而死亡、僵硬。

目前，常用傳統形態學的手段，常規培養后在顯微鏡下觀察菌絲和孢子形態差異來鑒定粉擬青霉。但鏡檢存在取樣不均一，準確度不高的問題，且操作費時，要求檢驗人員具備專業的理論知識和實踐技能。因此，發明一種能快速鑒別中藥材是否含有粉擬青霉或者鑒定待測樣品或者鑒定樣品是否為粉擬青霉的技術迫在眉睫。近年來，隨著中藥鑒定學的發展，中藥鑒定的新技術和新方法不斷被應用，其中分子生物學的引入，使得可以從基因層面解決中藥品種混亂的問題。尚未見報道從基因特異性引物擴增特異性片段層面去鑒定粉擬青霉。

發明內容

為彌補現有技術的空白，解決現有技術的缺陷，本發明提供了一種基于粉擬青霉ITS基因設計的鑒定粉擬青霉菌的特異性引物、試劑盒、方法及其應用。本發明首次對粉擬青霉進行了特異性引物的設計，適用于檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有粉擬青霉菌；鑒定或輔助鑒定待測樣品是否為粉擬青霉菌。本發明提供的特異性引物對通過PCR技術可以快速、準確、靈敏地實現上述應用，且引物特異性強，準確度高，擴增效果好，重復性好，耐受性好，適宜推廣應用。

具體的，

一方面，本發明提供了一種鑒定粉擬青霉菌的特異性引物，其序列如下：

NF154：5’-CCCAAACTCTGTATTCTC-3’；

NR428：5’-GGCCGGCGGTATACAG-3’。

一方面，本發明提供了一種鑒定粉擬青霉菌的試劑盒，包含以下引物：

NF154：5’-CCCAAACTCTGTATTCTC-3’；

NR428：5’-GGCCGGCGGTATACAG-3’。

另一方面，本發明提供了一種鑒定粉擬青霉菌的方法，包括使用本發明所述的引物或本發明所述的試劑盒。

另一方面，本發明提供了一種鑒定粉擬青霉菌的方法，包括步驟：

a)提取待測樣品的基因組DNA；

b)利用本發明所述的粉擬青霉菌特異性引物或本發明所述的鑒定粉擬青霉菌的試劑盒對步驟a)中的基因組DNA進行PCR擴增，獲得擴增產物；

c)利用步驟b)中獲得的擴增產物鑒定所述待測樣品。

在一些實施例中，PCR擴增條件為：94℃預變性3min；94℃變性15sec-45sec，49℃-58℃退火15sec–45sec，72℃延伸10sec，25-35個循環；72℃延伸5min。

在一些實施例中，PCR擴增條件為：94℃預變性3min；94℃變性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸10sec，30個循環；72℃延伸5min。