[發明專利]一種紫菜功能基因過表達質粒的構建方法和應用

在審

• 申請號: 201911196420.0
• 申請日: 2019-11-29
• 公開（公告）號: CN110777162A
• 公開（公告）日: 2020-02-11
• 發明（設計）人: 王廣策;鄭陣兵;何幫翔
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66;A01H13/00
• 代理公司: 21002 沈陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人: 何薇;李穎

本發明屬于海洋生物領域，具體地說涉及一種紫菜功能基因過表達質粒的構建方法和應用。構建方法：利用引物對擴增條斑紫菜光系統I捕光天線蛋白LHCI基因的CDS序列，而后將其連接至質粒PEA7上，即獲得條斑紫菜功能基因過表達質粒；本發明方法高效，成功率高，易于篩選。是研究紫菜功能基因作用機制的重要方法，為紫菜關鍵基因功能的分子生物學研究提供了一種有效途徑。

技術領域

本發明屬于海洋生物領域，具體地說涉及一種紫菜功能基因過表達質粒的構建方法和應用。

背景技術

紫菜口味鮮美，營養豐富，是我國也是世界上重要的經濟紅藻，具有很高的營養價值和經濟價值。其中條斑紫菜在我國江蘇省和山東省等地廣泛栽培，從業人員眾多，行業總產值巨大(每年約20億元)。此外，作為潮間帶的代表性大型海藻，條斑紫菜在進化上占據重要地位，是研究藻類及植物進化過程的模式材料。

2013年條斑紫菜的基因組信息由日本科學家測序完成。自此，條斑紫菜進入了分子生物學研究的新時期。雖然基因工程相關技術研究在高等植物中已十分成熟，但在大型經濟藻類中卻相對匱乏。條斑紫菜關鍵基因的功能研究由于缺乏有效的分子生物學手段而進展緩慢。如何利用基因工程的手段調控紫菜關鍵代謝通路中的關鍵基因表達成為亟待解決的問題。通過體內表達目的基因，使其上調表達是研究特定基因功能的有效途徑。近年來，日本科學家通過轉基因的方法成功在條斑紫菜中表達了包括GUS和CFP在內的多個報告基因，但卻沒有報道條斑紫菜功能基因成功表達實例。

發明內容

本發明的目的在于提供一種紫菜功能基因過表達質粒的構建方法和應用。

為實現上述目的，本發明采用技術方案為：

一種紫菜功能基因過表達質粒的構建方法，利用引物對擴增條斑紫菜光系統I捕光天線蛋白LHCI基因的CDS序列，而后將其連接至質粒PEA7上，即獲得條斑紫菜功能基因過表達質粒；

引物對：F:agcaagcccggatccatgttgg gctttgcgtcg，R：agatctgagtccggactagtggtggtggtggtggtgcgggaagagcttgccg。

所述條斑紫菜光系統I捕光天線蛋白LHCI基因的CDS序列插入質粒PEA7的啟動子和終止子之間，并在終止子前加入6個組氨酸密碼子gtg作為蛋白表達驗證標簽。

進一步的說

1)提取條斑紫菜總RNA，反轉成cDNA；

2)以上述cDNA為模板，用引物對擴增LHCI基因；

3)回收PCR產物，獲得目的基因；將其連接至質粒PEA7的啟動子和終止子之間，即構建得LHCI功能基因表達載體；其中，啟動子為紫菜PyAct1，終止子為NOS。

所述PCR擴增反應條件為：95℃變性30秒，65℃退火30秒，70℃延伸2分鐘，共計35個循環。

一種紫菜功能基因過表達質粒的應用，其特征在于：所述質粒在條斑紫菜內過表達調控紫菜代謝。

將所述質粒通過基因槍的方法進行質粒轉化，所述宿主為條斑紫菜葉狀體。

具體為：

擴增目的基因的CDS序列，構建表達載體。用基因槍轟擊質粒的方法把表達載體打進條斑紫菜葉狀體中。在抗生素篩選壓力下篩選存活藻株。驗證基因轉錄表達情況。

具體步驟如下：

1)提取條斑紫菜總RNA，反轉成cDNA，設計合適的引物擴增條斑紫菜功能基因的編碼序列。