[發明專利]基于Cas12a技術的外源基因定點敲入方法

有效

• 申請號: 201911194844.3
• 申請日: 2019-11-28
• 公開（公告）號: CN111004816B
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發明（設計）人: 吳森;杜旭光;李攀;張麗君;李智方;胥春龍
• 申請（專利權）人: 北京復昇生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/90;C12N15/65
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發明提供一種基于Cas12a技術的外源基因定點敲入方法。利用Cas12a設計一種依賴微同源臂的外源基因精確定點整合的方法(簡稱MITI)，該方法通過簡單的PCR或T4連接反應即可將識別序列插入到供體載體中，其中Cas12a在供體載體中的識別序列的方向與基因組中的靶點的方向是相反的，但遠離PAM端的Cas12a識別切割的5個堿基與基因組靶位點的最后5個堿基是相同的，因此可以利用內外源DNA產生的互補粘性末端實現無縫連接。在將外源基因整合到基因組中的特定位點以及在對內源基因進行標記時，相較已有的Cas9HITI策略，MITI可以產生更高的精準插入效率，其有望成為精準基因插入的新工具。

技術領域

本發明涉及基因體學及基因工程領域，具體地說，涉及一種基于Cas12a技術的外源基因定點敲入方法。

背景技術

位點特異的轉基因整合可以通過同源臂依賴的修復(homology-directedrepair,HDR)途徑實現也可以通過介導的末端連接(non-homology end joining,NHEJ)的途徑實現。通過同源臂依賴的修復途徑實現外源基因的精確整合往往是費時費力的，因為對于每一個基因它都需要進行同源臂克隆載體的構建。并且因為只有在細胞的S/G2期時，HDR途徑才可以有效的發揮作用，因此在非分裂細胞中，通過HDR介導的外源基因的整合的效率是非常低的。精確的位點特異性外源基因的整合也可以通過一種稱為ObLiGaRe(Obligate Ligation-Gated Recombination)的方法實現，它是利用zinc fingernucleases(ZFNs)或者Tale nucleases(TALENs)通過NHEJ途徑實現的，但是復雜的設計和高成本限制了它的廣泛應用。利用NHEJ途徑，CRISPR/Cas9已經在斑馬魚、哺乳動物等細胞中實現了外源基因的方便快捷及高效的定點整合，然而在外源基因和內源靶點的兩端的接頭處往往會出現各式各樣的突變。多項研究致力于優化這個系統，利用通過將FKBP12-L106P降解domain和Cas9相連接，從而控制Cas9蛋白的表達，以及利用相同的gRNA同時切割供體載體和基因靶點的HITI(Homology-independent target integration)策略。

利用Cas9可以通過非同源末端連接的途徑將外源DNA高效整合到基因組中，然而這些整合通常是不精確的，在外源DNA和內源基因的兩端接頭處經常會出現突變。

Cas12a是Cas12家族最新發現的一個RNA介導的核酸酶，與Cas9相比它擁有多種不同的優勢，例如更低的容錯率以及更高的特異性，Cas12a可以成熟自己的CRISPR RNAs(CrRNAs)成為成熟的CrRNAs，從而實現多基因的同時打靶。基于這些體外的比較研究，推測Cas12a可用于哺乳動物細胞中基因的精準定點插入。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于Cas12a技術的外源基因定點敲入方法。

本發明構思如下：利用Cas12a切割基因組產生粘性末端(而Cas9產生平末端，Cas9產生的平末端使得它主要利用Gibson組裝的方法進行體外分子克隆)，當Cas12a的CrRNA的長度在20nt或者更長的情況下，Cas12a主要切割CrRNA識別序列中PAM序列下游非模板鏈的第18nt的位置，模板鏈的第23nt的位置，產生一個5nt的粘性末端；當Cas12a的CrRNA的長度小于20nt的情況下，Cas12a主要切割CrRNA識別序列中PAM序列下游非模板鏈的第14nt的位置，模板鏈的第22nt的位置，產生一個8nt的粘性末端。這一特性使得Cas12a能夠像限制性內切酶一樣實現DNA的體外組裝。