[發明專利]基于Cas12a技術的外源基因定點敲入方法

有效

• 申請號: 201911194844.3
• 申請日: 2019-11-28
• 公開（公告）號: CN111004816B
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發明（設計）人: 吳森;杜旭光;李攀;張麗君;李智方;胥春龍
• 申請（專利權）人: 北京復昇生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/90;C12N15/65
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

1.基于Cas12a技術的外源基因定點敲入方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)根據真核宿主細胞基因組DNA，選擇合適靶點，設計并合成CrRNA序列：根據CrRNA作用位點的DNA序列5′-TTTV-N₁-N₂-……-N_x-5-N_x-4-N_x-3-N_x-2-N_x-1-N_x-3′，其中TTTV為PAM，V表示堿基A、C或G，x為20～23之間的整數，設計并合成針對上述作用位點的CrRNA序列，并將CrRNA序列構建到含有pol II類型啟動子、Cas12a Direct repeat序列以及表達Cas12a的TE4396骨架載體中，得到CrRNA與Cas12a的共表達載體；

2)構建攜帶CrRNA識別序列和外源基因表達盒的供體載體，其中CrRNA識別序列位于外源基因表達盒的5′端；所述CrRNA識別序列與步驟1)的CrRNA作用位點的DNA中TTTV-N₁-N₂-……-N_x-5序列相同，但方向相反，所述CrRNA識別序列中遠離PAM端的Cas12a識別切割的堿基序列與步驟1)的CrRNA作用位點的DNA中N_x-4-N_x-3-N_x-2-N_x-1-N_x的堿基序列相同，且方向相同；其中，N表示堿基A、T、G或C；

3)將CrRNA、CrRNA與Cas12a的共表達載體和供體載體共同導入真核宿主細胞中，篩選陽性轉化子。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中所述Cas12a Direct repeat序列為5′-aatttctactcttgtagat-3′。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中所述pol II類型啟動子為人U6啟動子。

4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，x＝23。