[發(fā)明專(zhuān)利]一種過(guò)表達(dá)二羥異戊酸脫水酶的葡萄汁酵母菌株及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911194798.7
• 申請(qǐng)日: 2019-11-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110951633A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張翠英;李憑;李彤;肖冬光;于愛(ài)群;郭學(xué)武;陳葉福;董健;林良才
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/19
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/19;C12G1/02;C12R1/85
• 代理公司: 北京領(lǐng)科知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 艾變開(kāi);劉玉玲

本發(fā)明提供了一株過(guò)表達(dá)二羥異戊酸脫水酶的葡萄汁酵母菌株及其應(yīng)用，該葡萄汁酵母菌株可以降低雙乙酰的含量，聯(lián)合過(guò)表達(dá)羥酸還原異構(gòu)酶，或者部分敲除α?乙酰乳酸合成酶編碼基因ILV2后，可以進(jìn)一步降低雙乙酰的含量，并且降低高級(jí)醇的含量。利用該菌株發(fā)酵提高了葡萄酒的風(fēng)味質(zhì)量，可釀造出風(fēng)味優(yōu)良且更有利于健康的葡萄酒。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物工程和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及工業(yè)微生物的育種及其應(yīng)用，具體是涉及一種過(guò)表達(dá)二羥異戊酸脫水酶的葡萄汁酵母菌株及其在制備葡萄酒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

葡萄酒是世界上最古老的具有濃厚文化底蘊(yùn)的綠色保健飲料，也是現(xiàn)代生活中不可或缺的飲品。葡萄酒中的香氣成分復(fù)雜多樣，相對(duì)含量從每升幾納克到幾百毫克不等，在葡萄酒的呈香過(guò)程中起到重要作用。

雙乙酰，又稱(chēng)2,3-丁二酮，是葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中的重要副產(chǎn)物，葡萄酒中雙乙酰的含量超過(guò)閾值就會(huì)產(chǎn)生令人不快的餿飯味，嚴(yán)重破壞葡萄酒的風(fēng)味，并影響葡萄酒的感官質(zhì)量。因此，葡萄酒中的雙乙酰含量必須控制在合適的范圍內(nèi)。目前對(duì)于雙乙酰調(diào)控的研究主要集中在啤酒發(fā)酵過(guò)程中。劉光誠(chéng)等人發(fā)明了七日釀酒法，即在糖化和發(fā)酵過(guò)程中加入具有超強(qiáng)的電子還原性和離子交換功能的隕水速成劑，大幅降低了雙乙酰指標(biāo)，改善啤酒的品質(zhì)(中國(guó)專(zhuān)利，CN107619733A，2018-01-23)。趙云財(cái)?shù)热酥谱饕环N富含α-氨基氮的啤酒專(zhuān)用麥芽糖漿，并用該麥芽糖漿作輔料生產(chǎn)啤酒，可以大幅度降低雙乙酰含量，提高啤酒的非生物穩(wěn)定性(中國(guó)專(zhuān)利，CN103571672A，2014-02-12)。李紅等人采用含有適當(dāng)濃度D-纈氨酸的13°P麥汁在適當(dāng)條件下馴化酵母，從酵母泥中篩選出對(duì)D-Val敏感的菌株并進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)敏感菌株雙乙酰含量，其降低率可達(dá)到34.08％(中國(guó)專(zhuān)利，CN104877922A，2015-09-02)。但上述工藝和菌株主要用于啤酒上，并未將其應(yīng)用于葡萄酒，而且菌株通過(guò)篩選突變而來(lái)，重復(fù)性差。

二羥異戊酸脫水酶編碼基因ILV3是將高級(jí)醇的氨基酸分解代謝途徑(Ehrlich途徑)和糖代謝合成途徑(Harris途徑)相關(guān)基因，目前對(duì)它的研究主要集中在該基因?qū)Ω呒?jí)醇的影響，例如，有學(xué)者認(rèn)為二羥異戊酸脫水酶會(huì)增加高級(jí)醇中異丁醇的含量，可以通過(guò)敲除ILV3基因而降低異丁醇的含量(過(guò)量表達(dá)釀酒酵母ZWF1基因?qū)Ξ惗〈籍a(chǎn)量的影響，李敬知等，中國(guó)科技論文，第12卷，第6期，2017年3月)。然而這些基因?qū)﹄p乙酰的影響未見(jiàn)報(bào)道。

在釀酒過(guò)程中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是傳統(tǒng)普遍應(yīng)用的酵母菌種，但研究發(fā)現(xiàn)，在現(xiàn)代葡萄酒發(fā)酵中的非釀酒酵母數(shù)量較高(每毫升10⁶-10⁸個(gè)細(xì)胞數(shù)量)且持續(xù)存在，其與釀酒酵母一樣在產(chǎn)生酒精的同時(shí)對(duì)葡萄酒的風(fēng)味和香氣等感官特征有著重要的影響，這導(dǎo)致人們又重新看待這些酵母在釀酒中的作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程改造非釀酒酵母獲得具有新的理想特征的各種酵母菌種，釀造具有復(fù)雜口感、風(fēng)格獨(dú)特的葡萄酒將會(huì)成為現(xiàn)代葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要方向。

發(fā)明內(nèi)容：

本申請(qǐng)發(fā)現(xiàn)，葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)是一種具有潛在的釀酒特性的非釀酒酵母，其在高產(chǎn)甘油和低產(chǎn)乙醇的同時(shí)，也能比釀酒酵母產(chǎn)生更多的芳香物質(zhì)。利用分子育種技術(shù)構(gòu)建調(diào)控雙乙酰的過(guò)表達(dá)二羥異戊酸脫水酶葡萄汁酵母工業(yè)菌株，對(duì)提高葡萄酒的風(fēng)味質(zhì)量具有重要意義。因此，

本發(fā)明的第一方面，提供一種低產(chǎn)雙乙酰的葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)菌株，所述菌株過(guò)表達(dá)二羥異戊酸脫水酶。

優(yōu)選的，所述菌株還部分敲除編碼α-乙酰乳酸合成酶的ILV2基因，優(yōu)選的，所述菌株還低產(chǎn)高級(jí)醇。

更優(yōu)選的，所述菌株還過(guò)表達(dá)羥酸還原異構(gòu)酶。

更優(yōu)選的，所述菌株過(guò)表達(dá)二羥異戊酸脫水酶和部分敲除編碼α-乙酰乳酸合成酶的ILV2基因，或者，所述菌株過(guò)表達(dá)二羥異戊酸脫水酶和羥酸還原異構(gòu)酶。