[發明專利]一種血清淀粉樣蛋白A突變體及其應用和制備方法

在審

• 申請號: 201911191944.0
• 申請日: 2019-11-28
• 公開（公告）號: CN110746499A
• 公開（公告）日: 2020-02-04
• 發明（設計）人: 王民燕;劉東海;褚旭明;夏杰;王益棟;李雪梅
• 申請（專利權）人: 寧波賽珀生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 11246 北京眾合誠成知識產權代理有限公司
• 代理人: 王學芝

本發明公開了一種血清淀粉樣蛋白A突變體，所述突變體具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列，經過幾個氨基酸的替換后仍具有血清淀粉樣蛋白的抗原性，得到唯一的突變體。本發明通過對天然SAA蛋白中的4個氨基酸進行替換，得到SAA突變體，提高了其體外穩定性。實驗證明，本發明所獲得SAA蛋白為可溶的成熟蛋白，最大可能的保持了其活性，保留了天然SAA蛋白的抗原性。本發明還公開了該血清淀粉樣蛋白A突變體的應用以及制備方法。

技術領域

本發明涉及生物技術技術領域，尤其是涉及一種血清淀粉樣蛋白A突變體。本發明還涉及該突變體的應用和制備方法。

背景技術

血清淀粉樣蛋白A(Serum Amyloid Protein A，SAA)是一種急性時相反應蛋白，屬于載脂蛋白家族中的異質類蛋白，相對分子量約12 000。肝內合成的SAA釋放入血后，迅速與HDL結合。在體內的代謝主要通過血清、細胞表面及細胞內的蛋白酶降解，肝臟是其主要的降解場所。肝外細胞產生的SAA主要通過細胞間的黏附及內吞作用經細胞表面或細胞內的蛋白酶降解。SAA在各急性時相蛋白中反映最敏銳，疾病好轉、康復，SAA首先下降并回歸正常。近20年來全世界的臨床研究均表明SAA也是一項疾病動態監測的優秀指標，對同一患者的同一疾病，相隔數天，SAA隨疾病的變化波動會很大。SAA在疾病的治療效果評價和預后評估上有較高的臨床價值。

目前，用于臨床血清SAA檢測的方法主要包括放射性免疫測定法(RIA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫速率散射比濁法、微球捕獲酶免疫法(MEIA)等。這些方法中都需要用到不同或一定濃度的SAA抗原作為標準品制作標準曲線，從而計算樣品中SAA的含量。國內禁止買賣人血清，從國外購買SAA成本昂貴且來源有限，發展重組SAA代替人源SAA非常有必要。目前重組表達的SAA蛋白非常容易形成聚集與降解，在體外的穩定性非常不好，容易降解，并且不容易獲得具有天然結構的SAA蛋白，這些缺點大大地限制了SAA的應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種血清淀粉樣蛋白A突變體，它具有體外穩定性較佳，具有天然抗原性的特點。本發明還公開了該血清淀粉樣蛋白A突變體的應用以及制備方法。

本發明所采用的技術方案是：

一種血清淀粉樣蛋白A突變體，所述突變體具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列，經過幾個氨基酸的替換后仍具有血清淀粉樣蛋白的抗原性，得到唯一的突變體。

所述突變體具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列。

所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或者所述基因具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

一種重組載體，所述載體含有前述的基因。

血清淀粉樣蛋白A突變體，在制備血清淀粉樣蛋白A抗原中的應用。

血清淀粉樣蛋白A突變體，在血清淀粉樣蛋白A檢測試劑中標準曲線繪制中的應用。

一種血清淀粉樣蛋白A突變體的制備方法，包括以下步驟：

1)血清淀粉樣蛋白A突變體氨基酸序列的設計：根據NCBI網站公布的SAA蛋白的氨基酸序列以及該序列的特征，將第52位氨基酸由Ala替換為Val，第57位氨基酸由Val替換為Ala，第60位氨基酸由Asp替換為Asn，第71位氨基酸由His替換為Arg，獲得SEQ ID NO.1；

2)血清淀粉樣蛋白A突變體基因的優化和獲得：采用大腸桿菌優勢密碼子對SEQID NO.1進行優化，得到SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，通過退火延伸PCR技術，獲得由大腸桿菌優勢密碼子組成的血清淀粉樣蛋白突變體基因；