[發明專利]一種大鼠煙氣吸入暴露后尿液的致突變檢測方法

有效

• 申請號: 201911191721.4
• 申請日: 2019-11-28
• 公開（公告）號: CN110656154B
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發明（設計）人: 蔡繼寶;蘇加坤;郭磊;徐達;羅娟敏;尚平平;李翔;謝復煒
• 申請（專利權）人: 江西中煙工業有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12R1/42
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種大鼠煙氣吸入暴露后尿液的致突變檢測方法，包括尿液酶解、過柱和萃取、洗脫、濃縮、Ames試驗微量波動法和結果判定共六個步驟，其中尿液酶解采用乙酸鈉?乙酸緩沖液調節控制pH環境，過柱時依次用甲醇和水預處理，并在去離子水沖洗后用甲醇洗脫，經濃縮后采用Ames試驗微量波動法檢測并判定結果，該方法可以顯著降低傳統Ames試驗所需的尿液檢測量，并提高檢測靈敏度，尤其適用于大鼠煙氣暴露模型的生物學檢測。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種大鼠煙氣吸入暴露后尿液的致突變檢測方法。

背景技術

卷煙煙氣是含有6000多種化合物的復雜氣溶膠，其中有69種被IARC確定為人類致癌物。卷煙煙氣中的多環芳烴、各種烷化劑、苯系物、芳香胺等致突變物質，這些物質進入人體或實驗動物體內后，經體內代謝，多以原型、代謝產物或是結合物等形式從腎臟排出，因此采用短期的致突變試驗檢測尿液的誘變作用具有重要的意義。

人群煙氣暴露存在很大的差異性，因此以Sprague Dawley大鼠作為試驗對象，檢測煙氣暴露不同周期后大鼠尿液的致突變性，可直接反應煙氣吸入暴露的致突變作用。但由于目前的現有技術中，尿液致突變試驗的尿液前處理方法，尿液需要量在50~100 mL以上或更多的，因此，現有方法僅適用于人體尿液的致突變檢測，而大鼠尿液量極少，采用現有方法無法有效評價其致突變性。

Ames等人曾采用鼠傷寒沙門氏菌在微粒體酶系統存在時，以傳統平板摻入法檢測尿液的致突變性，由于該方法每平皿的受試物限制為0.1 mL，而且尿液中的組氨酸也可干擾實驗結果，因此該傳統方法只能檢測高濃度的致突變物，對致突變物質的濃度較低的尿液無法適用。

發明內容

本發明的目的在于建立一種大鼠煙氣吸入暴露后尿液的致突變檢測方法，采用酶解、過柱、萃取、濃縮等方法來處理尿液，使尿液檢測量至少降低10倍，并且研究建立了尿液酶解濃縮后的Ames試驗微量波動法，提高了檢測的靈敏度，可作為煙氣暴露的生物學檢測指標。

為了實現上述發明目的，本發明提供了以下技術方案：

一種大鼠煙氣吸入暴露后尿液的致突變檢測方法，包括以下步驟：

S1.尿液酶解

將預先收集的尿樣解凍至室溫，取5 mL于玻璃瓶中，依次加入8~15mL 乙酸鈉-乙酸緩沖液和50 μL β-葡萄糖醛酸酶，混合均勻后放入恒溫水浴槽中，在37 ℃下避光酶解14~20 h；

S2.過柱和萃取

稱取XAD-2吸附劑1.05±0.05 g，置入層析柱內，首先用甲醇5~10mL浸潤萃取，近流完時，加入5~10mL水來進行預處理，近流完時，加入酶解的尿樣；

S3.洗脫

加入去離子水5~8 mL沖洗層析柱，洗去尿液中存在的組氨酸，棄去沖洗液，隨后加入10 ~15mL甲醇于層析柱，洗脫XAD-2吸附劑上的尿液物質；

S4.濃縮

洗脫液放入氮吹儀，直至吹干，加入100 μL的二甲基亞砜（DMSO）萃取殘留物；

S5.Ames試驗微量波動法

鼠傷寒沙門氏菌TA98過夜培養后，將菌液稀釋至1~2×10⁸個/mL。將0.1 mL菌液、8.85 mL選擇指示生長培養基、0.1 mL尿液DMSO萃取液、0.25 mL的3.2mg%組氨酸、0.25 mL的0.8 mg%生物素、1.15mL的10%S9混勻，以0.2 mL/孔加入96孔細胞培養板，48孔/板，37℃培養48 h，溶劑對照為DMSO，陽性對照為環磷酰胺；

S6.結果判定