[發明專利]基于目標觸發的酶輔助發夾探針重塑的無標記比色傳感器及其應用

有效

• 申請號: 201911182211.0
• 申請日: 2019-11-27
• 公開（公告）號: CN110938690B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發明（設計）人: 黎泓波;蒲嘉美;劉明彬;趙衛華;王素琴
• 申請（專利權）人: 江西師范大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6825
• 代理公司: 鄭州優盾知識產權代理有限公司 41125
• 代理人: 冉珊敏

基于目標觸發的酶輔助發夾探針重塑的無標記比色傳感器及其應用，以核酸為靶標，在酶的輔助下反應并有多種途徑形成能產生比色信號的G?四鏈體序列，進行可視化檢測核酸的方法。該方法控制反應條件，在T4 DNA連接酶的作用下被目標基因打開的發夾探針(HGP)與另一條雙鏈DNA(DGP)連接在一起，完成重塑。然后在DNA聚合酶和限制性內切酶的協同作用下，目標DNA實現了循環利用，并且產生了多個生成G?四鏈體序列的渠道。本發明以酶輔助DNA反應，形成大量的G?四鏈體，通過紫外分光光度計進行檢測，也可以用肉眼進行可視化檢測。檢測方法便捷，所用材料均已商品化，生物安全性高。

技術領域

本發明屬于核酸可視化檢測領域，特別是指基于目標觸發的酶輔助發夾探針重塑的無標記比色傳感器及其應用。

背景技術

核酸的高靈敏檢測在生物醫藥應用領域極具潛力。DNA和RNA包含了疾病病理學特征和發展過程中重要的信息，可以作為研究癌癥發病機制、識別感染及其耐藥性的重要生物標志物。急性淋巴細胞白血病（ALL）作為最常見的人類惡性腫瘤疾病之一，在兒童中的患病率最高。Pax-5是在造血系統中發現的唯一paired-box（PAX）家族成員，它可以分為Pax-5a，Pax-5b，Pax-5c，Pax-5d和Pax-5e。其中，Pax-5a是最重要的，Pax-5通常是指Pax-5a。Pax-5對于B細胞分化和發育非常重要，其異常表達可引起B淋巴細胞性白血病。然而，目前關于變異的Pax5基因檢測及該基因在臨床急性淋巴細胞白血病患者中的表達的研究較少。因此，開發一些簡便有效的Pax-5基因檢測方法是非常迫切且極具生命學意義的。

然而由于核酸含量在生物體中非常低，對信號進行擴增放大的方法因此被廣泛應用，如PCR擴增或者實時PCR擴增。PCR擴增盡管有明顯的優勢，但昂貴的設備和專業技術人員的要求限制了該方法的廣泛使用。因此更加簡便的擴增方法成為研究的熱點。最近一些研究報道了G-四鏈體作為信號源的檢測手段都展現了良好的檢測性能，G-四鏈體是由四個鳥嘌呤（G）堿基首尾相連通過π-π堆積進一步形成的特殊類型的DNA二級結構，當與小分子（如氯化血紅素，硫黃素T（ThT）和N-甲基中卟啉IX（NMM））結合使用時，G-四鏈體可以用作構建一系列基于G-四鏈體的有效信號轉導子，并且不需要額外的對核酸進行修飾。因此，這種基于G-四鏈體構建的生物傳感器對核酸序列進行定量分析極具應用潛力。

發明內容

本發明提出基于目標觸發的酶輔助發夾探針重塑的無標記比色傳感器及其應用，解決了高靈敏檢測Pax-5的問題。

本發明的技術方案是這樣實現的：

基于目標觸發的酶輔助發夾探針重塑的無標記比色傳感器，包括發夾探針HGP和雙鏈DNA序列DGP，其中發夾探針HGP包括靶DNA配對區域、G-四鏈體序列區域和被目標基因打開后自身的雜交結合區域；雙鏈DNA序列DGP包括LCP和LGP兩條單鏈DNA，LGP為一段G-四鏈體序列；LCP包括與目標基因結合的區域、被核酸內切酶識別的序列區域，以及與LCP雜交結合的序列區域。

所述發夾探針HGP序列如SEQ ID No.1所示，其5'端修飾一個磷酸基團；LCP序列如SEQ ID No.2所示，LGP序列如SEQ ID No.3所示。

所述的無標記比色傳感器在制備高靈敏檢測Pax-5基因的試劑盒或檢測儀中的應用。

利用所述的無標記比色傳感器檢測Pax-5基因的方法，包括以下步驟：

（1）將單鏈DNA LCP和單鏈DNA LGP按1:1的體積比混合，37 ℃孵育，得雙鏈的DGP溶液，于4℃保存備用；

（2）將發夾探針HGP與不同濃度Pax-5的標準溶液在反應管中混合，加入緩沖液體系，37℃孵育2 h，再加入步驟（1）中的DGP溶液和T4 DNA連接酶孵育1 h，然后加入DNA聚合酶、dNTPs和限制性內切酶，使反應管內體系的體積為20 μL，于37℃孵育1.5 h，于80℃加熱20 min使酶失活；