[發明專利]基于目標觸發的酶輔助發夾探針重塑的無標記比色傳感器及其應用

有效

• 申請號: 201911182211.0
• 申請日: 2019-11-27
• 公開（公告）號: CN110938690B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發明（設計）人: 黎泓波;蒲嘉美;劉明彬;趙衛華;王素琴
• 申請（專利權）人: 江西師范大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6825
• 代理公司: 鄭州優盾知識產權代理有限公司 41125
• 代理人: 冉珊敏

1.基于目標觸發的酶輔助發夾探針重塑的無標記比色傳感器，其特征在于：包括發夾探針HGP和雙鏈DNA序列DGP，其中發夾探針HGP包括靶DNA配對區域、G-四鏈體序列區域和被目標基因打開后自身的雜交結合區域；雙鏈DNA序列DGP包括LCP和LGP兩條單鏈DNA，LGP為一段G-四鏈體序列；LCP包括與目標基因結合的區域、被核酸內切酶識別的序列區域，以及與LCP雜交結合的序列區域；

所述發夾探針HGP序列如SEQ ID No.1所示，其5'端修飾一個磷酸基團；LCP序列如SEQID No.2所示，LGP序列如SEQ ID No.3所示。

2.權利要求1所述的無標記比色傳感器在制備高靈敏檢測Pax-5基因的試劑盒或檢測儀中的應用。

3.利用權利要求1所述的無標記比色傳感器檢測Pax-5基因的非疾病診斷為目的的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）將單鏈DNA LCP和單鏈DNA LGP按1:1的體積比混合，37 ℃孵育2 h，得雙鏈的DGP溶液，于4℃保存備用；

（2）將發夾探針HGP與不同濃度Pax-5的標準溶液在反應管中混合，加入緩沖液體系，37℃孵育2 h，再加入步驟（1）中的DGP溶液和T4 DNA連接酶孵育1 h，然后加入DNA聚合酶、dNTPs和限制性內切酶，使反應管內體系的體積為20 μL，于37℃孵育1.5 h，于80 ℃加熱20min使酶失活；

（3）將經步驟（2）處理的反應體系冷卻到室溫，加入HEPES緩沖液和氯化血紅素溶液，37℃孵育40分鐘；

（4）向經步驟（3）處理的反應體系中加入雙氧水和3,3',5,5'-四甲基聯苯胺溶液，反應10 min后，采用紫外可見分光光度計檢測吸收峰的變化；

（5）根據檢測到的電信號變化值及其對應的Pax-5的標準溶液濃度，繪制標準曲線；

（6）用待測樣本溶液代替不同濃度Pax-5的標準溶液重復步驟（1）-（5），將測得的電信號變化值代入標準曲線得到待測樣本中Pax-5的濃度。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述步驟（1）中單鏈DNA LCP和單鏈DNALGP的物質的量濃度為10 μM。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述步驟（2）中發夾探針HGP的物質的量濃度為10 μM，體積為1 μL；不同濃度Pax-5的標準溶液的濃度分別為300 nM、200 nM、150 nM、100 nM、50 nM、25 nM、10 nM、1 nM、0.5 nM、0.1 nM、50 pM、25 pM、10 pM、5 pM、0 pM；緩沖液體系為1 μL 的CutSmart緩沖液和1 μL 的NEB buffer 2。

6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述步驟（2）中DGP溶液的體積為2 μL，T4DNA連接酶的濃度為1 U/mL，體積為2 μL；DNA聚合酶為0.5 μL濃度為5 U/μL的KlenowFragment；dNTPs濃度為10 mM，體積為1 μL；限制性內切酶為0.5μL濃度為10 U/μL的Nt.BbvCI。

7.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述步驟（3）中加入HEPES緩沖液的體積為108μL，濃度為10 mM；加入氯化血紅素溶液的體積為2μL濃度為50 μM。

8.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述步驟（4）中加入雙氧水的體積為10 μL，濃度為20 mM；3,3',5,5'-四甲基聯苯胺溶液的體積為10 μL，濃度為10 mM。

9.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述步驟（4）中紫外可見分光光度計的測試波長范圍為350-750 nm。