[發明專利]一種組織工程皮膚的制備方法

在審

• 申請號: 201911181680.0
• 申請日: 2019-11-27
• 公開（公告）號: CN110841113A
• 公開（公告）日: 2020-02-28
• 發明（設計）人: 陶冶;康曉菲
• 申請（專利權）人: 黑龍江紫泰科技有限公司
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/38;A61L27/54;A61L27/60;D01D5/00;B33Y10/00;B33Y70/00;B33Y80/00
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

一種組織工程皮膚的制備方法，屬于組織工程技術領域。為了解決目前在制作組織工程皮膚支架材料以及細胞與支架材料的相互作用方式還存在缺陷的問題，本發明提供了一種組織工程皮膚的制備方法。本發明所述的組織工程皮膚包括如下步驟(1)納米靜電紡絲材料的制備(2)人體皮膚細胞的培養(3)細胞培養至納米纖維材料上。利用本發明所述的組織工程皮膚的制備方法制備組織工程皮膚構建方法簡單，操作步驟少，且獲得良好的動物在體實驗效果。

技術領域

本發明屬于組織工程技術領域，具體涉及一種組織工程皮膚的制備方法。

背景技術

皮膚是人體最大的組織器官，是人體非特異性，免疫屏障，大面積皮膚缺損會引起嚴重的健康問題，甚至會威脅生命，然而大面積皮膚缺失修復一直是醫學難題，常規治療手段對患者造成極大生理和心理痛苦，而且容易造成感染、恢復速度慢、恢復疤痕不能得到控制、不能在創傷面進行有效的藥物治療。人們一直在尋找理想的皮膚替代物。

皮膚組織工程是利用生物學和工程學原理，構建出用于修復，維持和改善損傷組織功能的組織替代物，其核心是創造出一種三維生長支架，將由機體分離出的細胞進行體外復合培養，形成人工再生的真皮等同物或皮膚等同物，移植于需要修復，重建的皮膚病損出。種子細胞，支架材料以及細胞與支架材料的相互作用的方式是構建組織工程皮膚的3個基本要素。為了使組織工程皮膚更趨于真實，減少免疫排斥反應，目前針對這三方面存在的問題還有待進一步完善和解決。

發明內容

為了解決目前在制作組織工程皮膚支架材料以及細胞與支架材料的相互作用方式還存在缺陷的問題，本發明提供了一種組織工程皮膚的制備方法。本發明所述的組織工程皮膚的制備方法是利用皮膚細胞作為種子細胞進行培養擴增，以納米靜電紡絲材料作為支架，通過3D打印技術，將培養擴增的細胞打印到支架上，獲得組織工程皮膚，具體步驟如下：

(1)納米靜電紡絲材料的制備

配制以N,N-二甲基甲酰胺DMF為溶劑，質量分數為10-16％的PVP紡絲液，在紡絲瓶中29-31℃，溶脹22-26小時，然后利用靜電紡絲機將紡絲液加工成0.45mm-0.55mm厚的納米靜電紡絲材料；

(2)人體皮膚細胞的培養

取皮膚組織使用含抗生素的PBS緩沖液反復沖洗，剪裁至2-4cm²，置于蛋白酶液中37℃浸泡12-16h，分離表皮和真皮，將表皮置于含質量分數為1％胰酶的磷酸鹽緩沖液中在37℃下消化30分鐘，制得表皮細胞懸液；

將真皮勻漿置于I型膠原酶中在37℃下消化30分鐘，制得真皮細胞懸液；

分別使用含質量濃度為1.5％牛血清的DMEM培養基，中和表皮細胞懸液和真皮細胞懸液中的酶液，將中和后的表皮細胞懸液和真皮細胞懸液分別過濾，所得濾液離心后，獲得表皮原代細胞和真皮原代細胞，將表皮原代細胞和真皮原代細胞分別接種在含胎牛血清的DMEM培養基中進行培養后傳代，分別收集表皮和真皮細胞；

(3)細胞培養至納米纖維材料上，獲得組織工程皮膚

將步驟(2)獲得的表皮細胞培養液和真皮細胞培養液通過3D打印機打印于步驟(1)獲得的納米靜電紡絲材料上，獲得組織工程皮膚。

優選的，所述靜電紡絲機加工紡絲液的條件為：15-18kV電壓，毛細管和收集屏之間的距離為25-30cm，加工時間為2分鐘。

優選的，所述3D打印參數是利用AutoCAD軟件對3D生物打印機進行編程，根據納米纖維材料尺寸設計打印參數，打印噴嘴采用0.8-1.0mm，打印線速度為8-10厘米/min，打印厚度為1-2毫米，打印層數為兩層，打印溫度為37℃，打印濕度為60-70％。

優選的，還可以向步驟(1)的紡絲液中加入藥物。