[發明專利]一種組織工程皮膚的制備方法

在審

• 申請號: 201911181680.0
• 申請日: 2019-11-27
• 公開（公告）號: CN110841113A
• 公開（公告）日: 2020-02-28
• 發明（設計）人: 陶冶;康曉菲
• 申請（專利權）人: 黑龍江紫泰科技有限公司
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/38;A61L27/54;A61L27/60;D01D5/00;B33Y10/00;B33Y70/00;B33Y80/00
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

1.一種組織工程皮膚的制備方法，其特征在于，利用皮膚細胞作為種子細胞進行培養擴增，以納米靜電紡絲材料作為支架，通過3D打印技術，將培養擴增的細胞打印到支架上，獲得組織工程皮膚，具體步驟如下：

(1)納米靜電紡絲材料的制備

配制以N,N-二甲基甲酰胺DMF為溶劑，質量分數為10-16％的PVP紡絲液，在紡絲瓶中29-31℃，溶脹22-26小時，然后利用靜電紡絲機將紡絲液加工成0.45mm-0.55mm厚的納米靜電紡絲材料；

(2)人體皮膚細胞的培養

取皮膚組織使用含抗生素的PBS緩沖液反復沖洗，剪裁至2-4cm²，置于蛋白酶液中37℃浸泡12-16h，分離表皮和真皮，將表皮置于質量分數為1％胰酶的磷酸鹽緩沖液中在37℃下消化30分鐘，制得表皮細胞懸液；

將真皮勻漿置于I型膠原酶中在37℃下消化30分鐘，制得真皮細胞懸液；

分別使用含質量濃度為1.5％牛血清的DMEM培養基，中和表皮細胞懸液和真皮細胞懸液中的酶液，將中和后的表皮細胞懸液和真皮細胞懸液分別過濾，所得濾液離心后，獲得表皮原代細胞和真皮原代細胞，將表皮原代細胞和真皮原代細胞分別接種在含胎牛血清的DMEM培養基中進行培養后傳代，分別收集表皮和真皮細胞；

(3)細胞培養至納米纖維材料上，獲得組織工程皮膚

將步驟(2)獲得的表皮細胞培養液和真皮細胞培養液通過3D打印機打印于步驟(1)獲得的納米靜電紡絲材料上，獲得組織工程皮膚。

2.根據權利要求1所述的組織工程皮膚的制備方法，其特征在于，所述靜電紡絲機加工紡絲液的條件為：15-18kV電壓，毛細管和收集屏之間的距離為25-30cm，加工時間為2分鐘。

3.根據權利要求1所述的組織工程皮膚的制備方法，其特征在于，所述3D打印參數是利用AutoCAD軟件對3D生物打印機進行編程，根據納米纖維材料尺寸設計打印參數，打印噴嘴采用0.8-1.0mm，打印線速度為8-10厘米/min，打印厚度為1-2毫米，打印層數為兩層，打印溫度為37℃，打印濕度為60-70％。

4.根據權利要求1所述的組織工程皮膚的制備方法，其特征在于，還可以向步驟(1)的紡絲液中加入藥物。

5.根據權利要求4所述的組織工程皮膚的制備方法，其特征在于，所述藥物是青霉素、阿莫西林、阿奇霉素、羅紅霉素、土霉素和四環素中的一種或多種的混合物。

6.根據權利要求5所述的組織工程皮膚的制備方法，其特征在于，所述藥物是以DMF為基準計，質量分數小于3％。

7.根據權利要求1所述的組織工程皮膚的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的PVP紡絲液是以DMF為基準計，PVP質量分數為16％。

8.根據權利要求1所述的組織工程皮膚的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的溶脹溫度是30℃，溶脹時間是24小時。

9.根據權利要求2所述的組織工程皮膚的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的電壓是15kV，毛細管和收集屏之間的距離為30cm。

10.根據權利要求1所述的組織工程皮膚的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的過濾是采用100μm的過濾篩網進行過濾的。