[發明專利]擬南芥突變體的原生質體在分析信號轉導途徑中的應用

有效

• 申請號: 201911178502.2
• 申請日: 2019-11-27
• 公開（公告）號: CN110878323B
• 公開（公告）日: 2021-12-28
• 發明（設計）人: 李寧;黃黎君;繆文卓;江文翰;彭明博;萬文凱
• 申請（專利權）人: 中南林業科技大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 閆書寧

本發明公開了擬南芥突變體的原生質體在分析信號轉導途徑中的應用。分析信號轉導途徑的步驟為：(1)構建蛋白融合報告基因表達載體、效應載體和內部對照載體；蛋白融合報告基因表達載體表達含有蛋白標簽甲的融合蛋白；融合蛋白由目的蛋白甲和螢火蟲熒光素酶組成；效應載體表達含有蛋白標簽乙的目的蛋白乙；內部對照載體表達海腎熒光素酶；(2)將蛋白融合報告基因表達載體、效應載體和內部對照載體在擬南芥突變體的原生質體中瞬時表達，然后分析信號轉導途徑。本發明為擬南芥原生質體中植物激素信號通路的重建和研究提供了一種新的策略，具有重要的應用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及擬南芥突變體的原生質體在分析信號轉導途徑中的應用。

背景技術

植物在生長過程中不斷地受到各種各樣的環境壓力，這些壓力會對植物的生長和產量帶來負面影響。為了應對不同的環境脅迫，植物進化產生了特定的信號網絡來協調其生長與發展和環境適應。了解這些信號轉導途徑的分子機制對于培育對環境脅迫具有耐受性的植物非常重要。由于其復雜性，植物信號轉導途徑的研究非常費時費力。而且，大部分植物沒有基因組序列、轉基因方法或突變體文庫等，信號途徑的研究更具挑戰性。目前，只有在一些模式植物(如擬南芥、水稻、煙草和番茄)中，JA茉莉酸(JA)信號通路研究的相對較為透徹。

植物激素茉莉酸(JA)由脂肪酸衍生，參與調節很多植物發育和環境脅迫反應。JA通過茉莉單?；?L-氨基酸合成酶的催化與異亮氨酸結合，形成主要的具有生物活性的JA衍生物，即茉莉單酰基-L-異亮氨酸(JA-Ile)。在過去的幾十年中，遺傳、生物化學和蛋白質結構分析等方法的結合已經確定了模式植物擬南芥中JA信號轉導的核心成分。JA-Ile促使F-box蛋白CORONATINE INSENSITIVE1(COI1)和JASMONATE-ZIM DOMAIN(JAZ)轉錄阻抑蛋白相互作用，兩者協同起JA受體的作用。COI1作為E3泛素連接酶，將JAZ蛋白泛素化并隨后通過26S蛋白酶體降解。在沒有JA-Ile的情況下，JAZ通過與Novel Interactor of JAZ(NINJA)蛋白相互作用來募集轉錄共阻遏物，從而抑制MYC2轉錄因子。擬南芥JAZ蛋白家族有12個成員。所有JAZ蛋白都包含兩個保守的序列基序：介導NINJA相互作用的ZIM-motif(也稱為TIFY-motif)和介導COI1相互作用的Jas-motif。COI1-JAZ受體復合物感應JA后，導致轉錄抑制因子JAZ的降解，從未釋放MYC2轉錄因子活性，MYC2進而激活JA調控基因的表達。

從植物組織新鮮分離的原生質體保持原有細胞的特性和分化狀態。從植物葉片中分離的葉肉原生質體表現出對外源激素、異源化學物質和環境刺激的生物學感知和生理反應，類似于完整組織和植物中的內部細胞。原生質體瞬時基因表達系統為研究亞細胞蛋白定位、轉錄調控、基因組編輯和植物合成生物學提供了寶貴的方法，由于其靈活性和便利性，已成為一種分子生物學研究領域里引人入勝的“瑞士軍刀”，用于解析各種植物信號轉導機制，進而研究信號通路。

發明內容

本發明的目的是研究信號轉導途徑，例如信號轉導途徑的組分、相互作用、調控物質等。

本發明首先保護一種分析信號轉導途徑的方法，可為采用擬南芥突變體的原生質體分析信號轉導途徑。

上述方法中，所述“采用擬南芥突變體的原生質體分析信號轉導途徑”的步驟可如下：

(1)構建蛋白融合報告基因表達載體、效應載體和內部對照載體；

蛋白融合報告基因表達載體中含有表達盒甲，表達盒甲從5’至3’依次包括啟動子甲、編碼蛋白標簽甲的核苷酸序列、目的蛋白甲的編碼基因和螢火蟲熒光素酶的編碼基因；蛋白融合報告基因表達載體表達含有蛋白標簽甲的融合蛋白；融合蛋白由目的蛋白甲和螢火蟲熒光素酶組成；

效應載體中含有表達盒乙，表達盒乙從5’至3’依次包括啟動子乙、編碼蛋白標簽乙的核苷酸序列和目的蛋白乙的編碼基因；效應載體表達含有蛋白標簽乙的目的蛋白乙；