[發(fā)明專利]一種表皮干細(xì)胞混懸液的制備方法及其應(yīng)用

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• 申請日: 2020-01-08
• 公開（公告）號: CN110938587A
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳莉;邢志青;王紅麗;周健;王杰;李冬麗
• 申請（專利權(quán)）人: 濟(jì)南磐升生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;A61K35/36;A61P17/02
• 代理公司: 濟(jì)南誠智商標(biāo)專利事務(wù)所有限公司 37105
• 代理人: 房一粟

本發(fā)明公開了表皮干細(xì)胞混懸液的制備方法及其應(yīng)用。該方法采用改良的組織貼壁法從人的包皮組織中獲得表皮干細(xì)胞和表皮干細(xì)胞因子，將收獲的表皮干細(xì)胞和表皮干細(xì)胞因子進(jìn)行混合，獲得細(xì)胞混懸液，將混懸液移植到皮膚創(chuàng)面，促進(jìn)表皮細(xì)胞的粘附、生長、遷徙，為后期表皮干細(xì)胞發(fā)揮修復(fù)作用提供良好的微環(huán)境。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種表皮干細(xì)胞混懸液的制備方法及其應(yīng)用，屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

皮膚創(chuàng)面修復(fù)是整形科和外科最常遇到的問題之一。皮膚創(chuàng)面修復(fù)是一個(gè)非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，如果皮膚創(chuàng)面較大，或合并糖尿病、感染、局部缺血缺氧及其他慢性疾病等將妨礙創(chuàng)面的正常愈合過程，從而導(dǎo)致創(chuàng)面延遲愈合甚至長期不愈合。

目前臨床上常用的創(chuàng)面治療方法有負(fù)壓引流、生物敷料、皮片移植以及皮瓣移植等，雖然取得了一定程度的療效，但失敗率近半數(shù)。深度創(chuàng)傷愈合后更是缺失毛囊、皮脂腺、汗腺等皮膚附屬器官，導(dǎo)致無法有效重建生理功能，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。

干細(xì)胞是具有自我復(fù)制和多向分化潛能的原始細(xì)胞，具有高度的增殖潛能和分化潛能，還可以分泌大量的細(xì)胞因子，參與組織修復(fù)、血管再生、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等。表皮干細(xì)胞是成體干細(xì)胞的一種，其增殖分化維系著表皮的正常結(jié)構(gòu)和生理功能，是皮膚及附屬器官發(fā)生、修復(fù)的基礎(chǔ)，也是皮膚創(chuàng)面修復(fù)過程中的重要種子細(xì)胞。表皮干細(xì)胞在特定誘導(dǎo)條件下可以誘導(dǎo)分化成皮膚和附屬器官，研究表面在缺失表皮干細(xì)胞的情況下，上皮組織的修復(fù)進(jìn)度將受到明顯的影響。組織工程表皮很多年前就被應(yīng)用于大面積燒傷的治療，對提高燒傷病人的存活率起了非常關(guān)鍵的作用，但是一般的組織工程表皮移植到人體后有很多問題，包括表皮容易增生過度、表皮容易起水泡、不能形成完整生理功能的皮膚，因此限制了臨床應(yīng)用和推廣。近幾年組織工程皮膚應(yīng)用較廣泛，它包含了真皮和表皮，是在體外用培養(yǎng)的表皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞和膠原蛋白合成的，臨床應(yīng)用于治療創(chuàng)面愈合有較好的療效。但是此類組織工程皮膚培養(yǎng)時(shí)間較長，需要較長時(shí)間才能形成皮膚結(jié)構(gòu)，耽誤了治療時(shí)機(jī)。

目前表皮干細(xì)胞的培養(yǎng)方法主要有兩種：一種是IV型膠原粘附法，這種方法培養(yǎng)的干細(xì)胞增殖較差；第二種是分選法，用免疫磁珠或者流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，得到較高純度的表皮干細(xì)胞，但是這種方法操作復(fù)雜，而且成本較高，不利于大規(guī)模推廣。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明克服了上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種表皮干細(xì)胞混懸液的制備方法及其應(yīng)用。該方法采用改良的組織貼壁法從人的包皮組織中獲得表皮干細(xì)胞和表皮干細(xì)胞因子，將收獲的表皮干細(xì)胞和表皮干細(xì)胞因子進(jìn)行混合，獲得細(xì)胞混懸液，將混懸液移植到皮膚創(chuàng)面，促進(jìn)表皮細(xì)胞的粘附、生長、遷徙，為后期表皮干細(xì)胞發(fā)揮修復(fù)作用提供良好的微環(huán)境。

一種表皮干細(xì)胞混懸液的制備方法，包括如下步驟：

(1)采集包皮組織，使用含抗生素的緩沖液處理后將組織切成小塊，加入Disapase酶溶液消化60-120min，消化后的組織將真皮和表皮分開；

(2)將步驟(1)獲得的表皮組織切碎后接種到預(yù)先用Coating Matrix處理過的培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中過夜；次日在上述培養(yǎng)皿中加入表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70～80％進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳到P3代細(xì)胞；

(3)步驟(2)獲得的P3代細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)P4代細(xì)胞，當(dāng)P4代細(xì)胞的融合度達(dá)到70-80％時(shí)收取培養(yǎng)液的上清液A，將上清液A離心，收集上清液B，將上清液B濃縮100過倍后過濾除菌，即可獲得表皮干細(xì)胞因子；

(4)步驟(3)獲得的P4代細(xì)胞消化，離心，收獲表皮干細(xì)胞懸液；

(5)將步驟(3)獲得的表皮干細(xì)胞因子和步驟(4)中獲得表皮干細(xì)胞培養(yǎng)液混合，獲得表皮干細(xì)胞混懸液。