[發明專利]一種表皮干細胞混懸液的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201911177830.0
• 申請日: 2020-01-08
• 公開（公告）號: CN110938587A
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發明（設計）人: 陳莉;邢志青;王紅麗;周健;王杰;李冬麗
• 申請（專利權）人: 濟南磐升生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;A61K35/36;A61P17/02
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 房一粟

1.一種表皮干細胞混懸液的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)采集包皮組織，使用含抗生素的緩沖液處理后將組織切成小塊，加入Disapase酶溶液消化60-120min，消化后的組織將真皮和表皮分開；

(2)將步驟(1)獲得的表皮組織切碎后接種到預先用Coating Matrix處理過的培養皿中，放入培養箱中過夜；次日在上述培養皿中加入表皮干細胞培養基繼續培養，當細胞融合度達到70～80％進行傳代培養，傳到P3代細胞；

(3)步驟(2)獲得的P3代細胞繼續傳代培養P4代細胞，當P4代細胞的融合度達到70-80％時收取培養液的上清液A，將上清液A離心，收集上清液B，將上清液B濃縮100過倍后過濾除菌，即可獲得表皮干細胞因子；

(4)步驟(3)獲得的P4代細胞消化，離心，收獲表皮干細胞懸液；

(5)將步驟(3)獲得的表皮干細胞因子和步驟(4)中獲得表皮干細胞培養液混合，獲得表皮干細胞混懸液。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述表皮干細胞培養基為添加牛垂體提取物、胰島素、纖維母細胞因子、維生素C、轉鐵蛋白、青霉素、鏈霉素的K-SFM角質培養基。

3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述的抗生素為青霉素-鏈霉素、兩性霉素B或慶大霉素的一種；所述緩沖液為pH7.4的磷酸鹽緩沖液、注射用生理鹽水或D-Hank’s液的一種。

4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述的Disapase酶溶液的濃度為2.5mg/mL。

5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述培養箱的培養條件為36-37℃、4.5-5％CO₂。

6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的傳代培養指表皮干細胞按照2-3×10⁴/cm²的密度傳代。

7.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述的完全培養基指含抗生素、10～15％胎牛血清的DME/F12，DMEM，高糖DMEM，α-MEM的其中一種。

8.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(5)中所述的表皮干細胞因子終濃度為25-50μg/ml。

9.利用如權利要求1-8任一項所述制備方法制備的表皮干細胞混懸液。

10.如權利要求1-8任一項所述制備方法制備的表皮干細胞混懸液在皮膚創傷愈合中的應用。