[發明專利]一種提高忍冬遺傳轉換效率的方法

在審

• 申請號: 201911164704.1
• 申請日: 2019-11-25
• 公開（公告）號: CN110904149A
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發明（設計）人: 劉國花;唐寧;李哲馨
• 申請（專利權）人: 重慶文理學院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 重慶樂泰知識產權代理事務所(普通合伙) 50221
• 代理人: 林慰敏

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種提高忍冬遺傳轉換效率的方法，包括如下步驟，S1、獲得用于侵染的外植體；S2、獲得含有目標基因的重組農桿菌菌液，使用該菌液侵染外植體；S3、培養侵染后的外植體，得到目標基因穩定表達的轉基因植株。本發明的有益效果是：本發明的重組農桿菌介導的丁香葉忍冬遺傳轉化方法，該方法重復性強，不受基因型限制，侵染效率能夠得到很大提高，轉化效率至少為40％，可以提高丁香葉忍冬的轉化率。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種提高忍冬遺傳轉換效率的方法。

背景技術

丁香葉忍冬(學名：Lonicera oblata)是忍冬科忍冬屬的植物，是中國的特有植物。分布在中國大陸的河北等地，生長于海拔1200米的地區，一般生于多石山坡上。

忍冬主要依靠人工栽培來滿足市場需求，但產量相對較少，遠不能滿足市場以及出口的需求，同時在人工栽培中，產量與品質參次不齊，制約了產業的高效發展，因此對如何提高忍冬遺傳轉換效率就顯得尤為重要。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種提高忍冬遺傳轉換效率的方法，可以顯著提高丁香葉忍冬的遺傳轉換效率。

本發明提供了如下的技術方案：

一種提高忍冬遺傳轉換效率的方法，包括如下步驟，

S1、獲得用于侵染的外植體；

S2、獲得含有目標基因的重組農桿菌菌液，使用該菌液侵染外植體；

S3、培養侵染后的外植體，得到目標基因穩定表達的轉基因植株。

優選的，S1中，所述外植體獲得方法如下，選擇丁香葉忍冬的莖段的腋芽，洗潔精清洗后用清水沖洗至無泡沫，在超凈臺中先用60-70％的酒精浸1-2分鐘，無菌水沖洗2-3次，用質量濃度為5-10％的次氯酸鈉溶液消毒3-5分鐘，用無菌水洗2-3次，放入初代啟動培養基中誘導腋芽萌發，待腋芽長至3-4cm時，移植到繼代培養基中增值，取繼代培養3-4w的無菌苗葉片作為外植體。

優選的，S2中，所述重組農桿菌為帶有gus基因的EHA105農桿菌，轉化所用載體為pCAMBIA2301。

優選的，S2中，侵染的具體方法為，將外植體置于分化培養基中預培養2-3天，用濃度為OD₆₀₀＝0.3-0.5的重組農桿菌菌液侵染外植體，侵染時間為4-20分鐘。

優選的，所述步驟S3的具體方法為將侵染后的外植體葉正面朝下轉接到分化培養基上，黑暗條件下培養1-2天，葉正面朝上轉接到含有15-30mg/L的卡那霉素和400-800mg/L的頭袍霉素的篩選培養基中培養，培養條件為溫度25±1℃、光照時間10-15h、光照強度1000-2000Lx。

優選的，所述初代啟動培養基的配方為：以MB為基本培養基，并添加6-BA 1mg/L、IAA 0.8mg/L，調節pH至5.6；

所述繼代培養基的配方為：以MB為基本培養基，并添加6-BA 0.5mg/L、IAA 0.8mg/L，調節pH至5.6。

優選的，所述分化培養基的配方為：以MB為基本培養基，并添加6-BA 1mg/L、KT2mg/L、NAA 0.1mg/L、調節pH至5.8。

優選的，所述篩選培養基的配方為：以MB為基本培養基，并添加DCR 2.0mg/L、TDZ0.05mg/L、NAA 20g/L，pH6.0

本發明的有益效果是：本發明的重組農桿菌介導的丁香葉忍冬遺傳轉化方法，該方法重復性強，不受基因型限制，侵染效率能夠得到很大提高，轉化效率至少為40％，可以提高丁香葉忍冬的轉化率。

具體實施方式