[發(fā)明專利]一種提高忍冬遺傳轉(zhuǎn)換效率的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911164704.1
• 申請日: 2019-11-25
• 公開（公告）號: CN110904149A
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉國花;唐寧;李哲馨
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶文理學(xué)院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 重慶樂泰知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 50221
• 代理人: 林慰敏

1.一種提高忍冬遺傳轉(zhuǎn)換效率的方法，其特征在于，包括如下步驟，

S1、獲得用于侵染的外植體；

S2、獲得含有目標(biāo)基因的重組農(nóng)桿菌菌液，使用該菌液侵染外植體；

S3、培養(yǎng)侵染后的外植體，得到目標(biāo)基因穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高忍冬遺傳轉(zhuǎn)換效率的方法，其特征在于，S1中，所述外植體獲得方法如下，選擇丁香葉忍冬的莖段的腋芽，洗潔精清洗后用清水沖洗至無泡沫，在超凈臺中先用60-70％的酒精浸1-2分鐘，無菌水沖洗2-3次，用質(zhì)量濃度為5-10％的次氯酸鈉溶液消毒3-5分鐘，用無菌水洗2-3次，放入初代啟動培養(yǎng)基中誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，待腋芽長至3-4cm時(shí)，移植到繼代培養(yǎng)基中增值，取繼代培養(yǎng)3-4w的無菌苗葉片作為外植體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高忍冬遺傳轉(zhuǎn)換效率的方法，其特征在于，S2中，所述重組農(nóng)桿菌為帶有g(shù)us基因的EHA105農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)化所用載體為pCAMBIA2301。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高忍冬遺傳轉(zhuǎn)換效率的方法，其特征在于，S2中，侵染的具體方法為，將外植體置于分化培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2-3天，用濃度為OD₆₀₀＝0.3-0.5的重組農(nóng)桿菌菌液侵染外植體，侵染時(shí)間為4-20分鐘。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高忍冬遺傳轉(zhuǎn)換效率的方法，其特征在于，所述步驟S3的具體方法為將侵染后的外植體葉正面朝下轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，黑暗條件下培養(yǎng)1-2天，葉正面朝上轉(zhuǎn)接到含有15-30mg/L的卡那霉素和400-800mg/L的頭袍霉素的篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25±1℃、光照時(shí)間10-15h、光照強(qiáng)度1000-2000Lx。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種提高忍冬遺傳轉(zhuǎn)換效率的方法，其特征在于，所述初代啟動培養(yǎng)基的配方為：以MB為基本培養(yǎng)基，并添加6-BA 1mg/L、IAA 0.8mg/L，調(diào)節(jié)pH至5.6；

所述繼代培養(yǎng)基的配方為：以MB為基本培養(yǎng)基，并添加6-BA 0.5mg/L、IAA 0.8mg/L，調(diào)節(jié)pH至5.6。

7.根據(jù)權(quán)利要求4或5中所述的一種提高忍冬遺傳轉(zhuǎn)換效率的方法，其特征在于，所述分化培養(yǎng)基的配方為：以MB為基本培養(yǎng)基，并添加6-BA 1mg/L、KT 2mg/L、NAA 0.1mg/L、調(diào)節(jié)pH至5.8。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種提高忍冬遺傳轉(zhuǎn)換效率的方法，其特征在于，所述篩選培養(yǎng)基的配方為：以MB為基本培養(yǎng)基，并添加DCR 2.0mg/L、TDZ 0.05mg/L、NAA 20g/L，pH6.0。