[發(fā)明專利]檢測(cè)EZH2的R342位點(diǎn)非對(duì)稱性二甲基化修飾的抗體

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911150672.X
• 申請(qǐng)日: 2019-11-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110687304A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-01-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李中偉;白津;鄭駿年;王典典;侯平甫;李敏樂(lè);柴大飛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 徐州醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 32321 南京業(yè)騰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙)
• 代理人: 李靜

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)EZH2的R342位點(diǎn)非對(duì)稱性二甲基化修飾的抗體，該抗體為多克隆抗體，抗體的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述抗體的制備方法：采用多肽合成技術(shù)，合成SEQ ID No.1所示抗體的多肽，然后與血藍(lán)蛋白KLH交聯(lián)，得到抗原；將抗原與完全佐劑或者不完全佐劑混合后注入動(dòng)物體內(nèi)免疫8次，取動(dòng)物全血，進(jìn)行純化，即得。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，EZH2的R342位能夠被PRMT1進(jìn)行非對(duì)稱性二甲基化修飾，并能顯著增強(qiáng)EZH2的蛋白穩(wěn)定性，本發(fā)明提供的抗體能有效的特異性識(shí)別EZH2中R342位的非對(duì)稱性二甲基化修飾情況，對(duì)于今后研究EZH2蛋白翻譯后修飾的調(diào)控，有至關(guān)重要的作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)EZH2的R342位點(diǎn)非對(duì)稱性二甲基化修飾的抗體，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

EZH2(Enhancer ofZeste Homolog 2)是一個(gè)重要的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠催化其靶基因的組蛋白H3第27位賴氨酸發(fā)生三甲基化修飾(H3K27me3)。人源EZH2是一個(gè)包含有20個(gè)外顯子長(zhǎng)約40kb的基因。EZH2基因編碼產(chǎn)生一個(gè)約100KD大小的蛋白，包含746個(gè)氨基酸殘基，在人和小鼠等多個(gè)物種間序列保守性很強(qiáng)。隨著研究的深入，越來(lái)越多的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)EZH2蛋白的翻譯后修飾(Post-Translational Modification，PTM)對(duì)其多種生物學(xué)功能的發(fā)揮起著重要作用。目前已知的EZH2翻譯后修飾主要集中在EZH2蛋白的磷酸化、乙酰化、糖基化和泛素化修飾，EZH2的甲基化修飾研究很少。

精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Protein Arginine Methyltransferases,PRMTs)是一類能夠?qū)M蛋白和非組蛋白精氨酸殘基進(jìn)行甲基化修飾的酶。精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMTs(ProteinArginine Methyltransferases,PRMTs)能夠催化來(lái)自S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到精氨酸胍基的氮原子上，可以形成三種類型的精氨酸甲基化修飾：?jiǎn)渭谆?MMA)、非對(duì)稱性二甲基化(ADMA)和對(duì)稱性二甲基化(SDMA)。蛋白的精氨酸非對(duì)稱性二甲基化修飾是一種非常重要的翻譯后修飾類型，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均發(fā)現(xiàn)許多受精氨酸非對(duì)稱性二甲基化修飾的蛋白。例如，PRMT1介導(dǎo)Twist的34位精氨酸發(fā)生非對(duì)稱性二甲基化修飾，可抑制E-cadherin表達(dá)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；PRMT1催化C/EBPα的35、156和165位精氨酸發(fā)生非對(duì)稱性二甲基化修飾，可促進(jìn)cyclin D1表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌腫瘤形成，等等。

EZH2是否能夠發(fā)生精氨酸非對(duì)稱性二甲基化修飾，迄今為止還沒(méi)有相關(guān)的任何研究報(bào)道，也沒(méi)有檢測(cè)EZH2非對(duì)稱性二甲基化修飾的抗體報(bào)道。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(Protein Arginine Methyltransferases 1，PRMT1)能夠催化EZH2的R342精氨酸發(fā)生非對(duì)稱性二甲基化修飾，并且修飾后能夠增強(qiáng)EZH2蛋白穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致EZH2在癌細(xì)胞中高表達(dá)，因此迫切需要一種用于檢測(cè)EZH2的R342位點(diǎn)非對(duì)稱性二甲基化修飾的抗體，來(lái)檢測(cè)EZH2的R342位點(diǎn)的非對(duì)稱性二甲基化修飾。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)EZH2的R342位點(diǎn)非對(duì)稱性二甲基化修飾的抗體，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)EZH2的R342位點(diǎn)非對(duì)稱性二甲基化修飾的快速特異性檢測(cè)。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述抗體的制備方法。

技術(shù)方案

PRMT1是PRMTs家族中酶活性最高的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，也是最主要的I類PRMT酶，細(xì)胞內(nèi)85％的精氨酸非對(duì)稱性二甲基化修飾都是由PRMT1介導(dǎo)產(chǎn)生的。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)PRMT1能夠?qū)ZH2的R342位點(diǎn)進(jìn)行非對(duì)稱性二甲基化修飾。本發(fā)明人運(yùn)用純化的GST-EZH2和GST-PRMT1蛋白，通過(guò)體外³H-SAM放射自顯影實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EZH2能夠被PRMT1進(jìn)行直接的甲基化修飾，并進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)：EZH2-R342能夠進(jìn)行非對(duì)稱性二甲基化修飾。