[發明專利]一種間充質干細胞生物學效力的檢測方法

在審

• 申請號: 201911149147.6
• 申請日: 2019-11-21
• 公開（公告）號: CN110938668A
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發明（設計）人: 劉廣洋;劉擁軍;張晨亮;李欣;米一;苗麗;馬靜
• 申請（專利權）人: 北京貝來生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N5/071;A61K35/28;A61P37/02
• 代理公司: 北京華夏正合知識產權代理事務所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營

本發明提供了一種間充質干細胞生物學效力的檢測方法，其特征在于通過ELISA方法檢測間充質干細胞培養上清中表達分泌型TNFRI的水平來判斷該細胞免疫抑制能力強弱，操作簡便，針對性強，定量準確，為間充質干細胞提供了較好的生物學效力檢測手段。

技術領域

本發明涉及一種間充質干細胞的檢測技術，具體地說，涉及一種間充質干細胞生物學效力的檢測方法，通過檢測間充質干細胞培養上清中抗炎因子水平作為間充質干細胞生物學效力的質量控制標準。

背景技術

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種主要的免疫調節和前炎性因子，因其在類風濕關節炎、潰瘍性結腸炎等自身免疫性疾病中的表現上調而被認為在其病理機制中發揮重要作用。在類風濕關節炎中TNF-α主要產生于RA滑膜中的滑膜巨噬細胞并刺激纖維母細胞增殖及淋巴細胞的活性。TNF-α生成的過程始于配體和細胞表面 Toll樣受體(TLR)結合，刺激信號轉導通路而激活NF-κB轉錄因子。被激活的NF-κB進入細胞核并誘導與炎癥有關基因的轉錄，而 TNF-α和其它炎性細胞因子的生成又募集其它炎性細胞依次釋放細胞因子進而放大免疫反應。許多動物實驗及臨床研究均證實阻滯 TNF-α活性對治療類風濕關節炎、潰瘍性結腸炎等眾多自身免疫性疾病有效。

臨床研究發現，間充質干細胞(mesenchymal stem cells， MSCs)可顯著(實質上)抑制類風濕關節炎病人體內活化的淋巴細胞，降低TNF-α水平，從而發揮免疫抑制及抗炎的特性，使得其在治療類風濕性關節炎等自身免疫性疾病方面具有廣闊的應用前景。然而，由于細胞治療本身的特點，間充質干細胞用于臨床治療還具有某些方面的限制因素。其中最典型的方面是缺乏有效而快捷的具有針對性的生物學效力檢測手段。目前多數臨床前或臨床使用的間充質干細胞產品都是參照2006年國際細胞治療協會提出的三條定義間充質干細胞標準[2]，而缺乏針對某一類疾病，特別是免疫抑制方面的可以定義細胞質量或初步判斷細胞治療效果的方法。國際細胞治療協會 (ISCT)于2015年的第21次干細胞年會明確提出：間充質干細胞應建立用于自身免疫性疾病臨床治療的標準，并建議將間充質干細胞分泌的抗炎因子作為檢測間充質干細胞生物學效力的標準(Jacques Galipeau,et al,.2016,Cytotherapy 18(2),151-159)。

而基于免疫細胞分泌的TNF-α與類風濕關節炎有密切的相關性，目前對間充質干細胞生物學效力檢測方法的通用做法是：利用健康人新鮮外周血中分離的淋巴細胞在PHA刺激下可分泌大量 TNF-α，而間充質干細胞與外周血單核細胞1:1至1:10共培養均可顯著抑制后者分泌TNF-α的水平，且抑制水平與間充質干細胞濃度呈正相關。該方法是根據間充質干細胞治療類風濕關節炎所發揮的免疫抑制和抗炎特性而設計的有針對性的檢測手段，可在體外檢測間充質干細胞的免疫抑制能力。然而在實際操作中發現該方法具有下述弊端：1.每次檢測均需要抽取健康人新鮮血液，給檢測帶來不便；2.每次檢測所取人外周血淋巴細胞來源于不同供者，因此批次之間存在不穩定性；3.該方法可提供間充質干細胞生物學效力的定性結果，然而無法給出定量指標；4.該方法需要先復蘇培養間充質干細胞后接種至 96孔板，然后與外周血淋巴細胞(加入PHA等刺激劑)共培養48-72 小時，最后檢測培養液中TNF-α水平，整個實驗需要6-7天，步驟繁多、工序復雜。

因此建立急需一種無需抽取人體新鮮血液，批次間穩定性高，耗時短，工序簡單的間充質干細胞生物學效力的檢測方法。

發明內容

本發明的目的在于克服現有間充質干細胞生物學效力檢測手段的不足，建立一套有效檢測間充質干細胞生物學效力的新方法。