[發明專利]一種豬卵母細胞體外成熟培養液及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201911148648.2
• 申請日: 2019-11-21
• 公開（公告）號: CN110684723B
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 金君學;孫婧陶
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

一種豬卵母細胞體外成熟培養液及其制備方法與應用，屬于卵母細胞體外成熟培養技術領域。為了解決目前豬卵母細胞體外成熟率和發育率低的問題，本發明提供了一種豬卵母細胞體外成熟培養液及其制備方法與應用。本發明所述的培養液由基礎培養液TCM?199，青霉素，鏈霉素，NaHCO₃，4?羥乙基哌嗪乙磺酸，聚乙烯醇，丙酮酸鈉，胰島素，半胱氨酸，表皮生長因子，豬卵泡液，孕馬血清促性腺激素，人絨毛膜促性腺激素和雷美替胺組成。本發明所述的培養液，可以提高卵母細胞體外成熟質量、卵丘細胞擴散指數、谷胱甘肽水平、孤雌胚胎囊胚率和囊胚總細胞數、體外受精胚胎卵裂率、囊胚率以及囊胚總細胞數；降低卵母細胞ROS水平。

技術領域

本發明屬于卵母細胞體外成熟培養技術領域。具體涉及一種豬卵母細胞體外成熟培養液及其制備方法與應用。

背景技術

現代生物學和生物醫學研究表明豬的生物學特性和遺傳特性與人類具有相當高的同源性，被認為是人體異種器官來源的首選動物，因此豬在生物醫學研究中是重要的模式動物。體外培養技術和當今飛速發展的基因編輯技術的有效結合，不僅促進了胚胎工程的發展及應用，而且帶動了醫學領域的發展。卵母細胞體外成熟(IVM)是胚胎體外生產(IVP)的重要一環，如今對豬卵母細胞體外成熟培養(IVM)的標準也在不斷的提升。盡管現在豬的卵母細胞IVM體系得到了很大的改善，但是豬卵母細胞體外成熟率仍然低于體內。

卵丘卵母細胞復合體(Cumulus-oocyte complexs，COCs)是由卵母細胞和其周圍的卵丘細胞組成。卵丘細胞在其生長和成熟過程中與卵母細胞在生理和代謝上結合，并參與排卵和受精。在卵泡生長過程中，卵丘細胞通過縫隙連接與卵母細胞緊密相連，縫隙連接允許雙向旁分泌，從而調節染色質重塑和卵母細胞中RNA合成等過程。此外，卵丘細胞還參與抗氧化和代謝過程并提供脂肪酸、碳水化合物和氨基酸等能量底物給卵母細胞，進而提高卵母細胞發育。相較體內環境而言，在體外發育的卵母細胞及早期胚胎發育能力受到影響，這很可能是由于活性氧(ROS)引起的氧化應激造成了胚胎細胞凋亡或永久性發育阻滯。在正常生理條件下，為維持氧化還原穩態，細胞內的抗氧化系統會清除過量的活性氧，在此過程中，谷胱甘肽(GSH)為保護細胞免受氧化應激發揮了重要作用，另外卵母細胞體外成熟后的谷胱甘肽水平也是卵母細胞胞質成熟的重要指標。

發明內容

為了解決目前豬卵母細胞體外成熟率和發育率低的問題，本發明提供了一種豬卵母細胞體外成熟培養液及其制備方法與應用。本發明所述的豬卵母細胞體外成熟培養液，含有雷美替胺。

優選的，所述卵母細胞體外成熟培養液，由基礎培養液TCM-199，青霉素，鏈霉素，NaHCO₃，4-羥乙基哌嗪乙磺酸Hepes，聚乙烯醇，丙酮酸鈉，胰島素，半胱氨酸，表皮生長因子，豬卵泡液，孕馬血清促性腺激素PMSG和人絨毛膜促性腺激素hCG組成，還含有雷美替胺。

優選的，所述卵母細胞體外成熟培養液，以TCM-199為基準計，青霉素的質量濃度為0.048-0.066g/L，鏈霉素的質量濃度為0.08-0.12g/L，NaHCO₃的濃度為1.95-2mmol/L，Hepes的濃度為9.5-10mmol/L，聚乙烯醇的質量濃度為2.5-3.5g/L，丙酮酸鈉的濃度為0.9-0.95mmol/L，胰島素的質量濃度為8-12ng/mL，半胱氨酸的濃度為0.5-0.7mmol/L，表皮生長因子的質量濃度為8-12ng/mL，豬卵泡液體積濃度為75-125mL/L，PMSG的濃度為8-12IU/mL，hCG的濃度為8-12IU/mL，雷美替胺的濃度為10^-11-10^-7mol/L。