[發明專利]一種β-葡萄糖苷酶及其制備方法與應用在審
| 申請號： | 201911146480.1 | 申請日： | 2019-11-21 |
| 公開（公告）號： | CN111304182A | 公開（公告）日： | 2020-06-19 |
| 發明（設計）人： | 樊明濤;張杰;趙寧;戚一曼 | 申請（專利權）人： | 西北農林科技大學 |
| 主分類號： | C12N9/42 | 分類號： | C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12G1/022 |
| 代理公司： | 西安恒泰知識產權代理事務所 61216 | 代理人： | 史玫 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 葡萄 糖苷酶 及其 制備 方法 應用 | ||
本發明公開了一種β?葡萄糖苷酶及其制備方法與應用。本發明所公開的β?葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所公開的制備方法包括基因組DNA的提取、目的基因擴增、載體構建、轉化、表達和純化。本發明的β?葡萄糖苷酶比活力達到了59.19μkat/g，約為3550U/g，高于經傳統方法表達的β?葡萄糖苷酶的比活力，且熱穩定性和pH穩定性良好，可用于葡萄酒釀制。
技術領域
本發明涉及生物制酶技術領域，特別是涉及一種酒類酒球菌來源的β-葡萄糖苷酶及其制備方法和應用。
背景技術
β-葡萄糖苷酶作為一種關鍵的糖苷水解酶，在葡萄酒增香的過程中扮演著重要的角色，但是β-葡萄糖苷酶的制備方法繁瑣，費時費力，產量低下，難以滿足生產要求。
發明內容
針對現有技術的缺陷或不足，本發明的目的之一是提供一種β-葡萄糖苷酶。
本發明所提供的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
同時本發明提供了一種β-葡萄糖苷酶的制備方法。本發明所提供的制備方法包括以下步驟：
(1)基因組DNA的提取：提取酒類酒球菌SD-2a的基因組DNA；
(2)目的基因擴增：以步驟(1)得到的基因組DNA為模板，進行聚合酶鏈式反應，擴增目的基因；
(3)載體構建：將擴增得到的目的基因插入表達載體PcoldI構建表達質粒PcoldI-0224；
(4)轉化：將表達質粒PcoldI-0224導入大腸桿菌感受態細胞DH5α，得到轉化子；
(5)表達：將轉化子進行擴大培養，提取培養物中的重組表達質粒PcoldI-0224導入感受態細胞BL21，之后進行擴大培養；
(6)純化：對步驟(5)的培養物依次進行裂解、過濾，之后依次采用His重力鎳柱和超濾管收集β-葡萄糖苷酶。
優選的，本發明制備方法中步驟(1)中提取對數中期酒類酒球菌SD-2a的基因組DNA。
優選的，本發明制備方法中步驟(2)擴增時所用引物序列分別為：
上游引物：5’-CTC
下游引物：5’-TGA
優選的，本發明制備方法步驟(2)中所用的DNA聚合酶為PrimeSTAR Max DNAPolymerase，PCR反應程序為：95℃預變性10min；98℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸60s，30次循環；72℃保溫8min。
本發明的β-葡萄糖苷酶可用于釀制葡萄酒，相比于現有的同類酶，該酶的催化性能增加，在用于釀制葡萄酒時，可增加酒中香氣物質的種類和含量、改善葡萄酒的風味、提高葡萄酒產品質量。
與傳統方法相比，本發明直接將目的基因與表達載體雙酶切后在DNA連接酶的作用下連接，不必經過傳統的T-A克隆程序，極大地節省了時間。
本發明重組酶的比活力達到了59.19μkat/g，約為3550U/g，高于經傳統方法表達的β-葡萄糖苷酶的比活力，且熱穩定性和pH穩定性良好。
附圖說明
圖1為本發明實施例中制備的β-葡萄糖苷酶和酒酒球菌PSU-1中的β-葡萄糖苷酶蛋白序列比對；
圖2為本發明實施例中表達質粒PcoldI-0224的構建過程圖；
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