[發明專利]一種高地芽孢桿菌J45及其獲取方法與應用有效

申請號：	201911143374.8	申請日：	2019-11-20
公開（公告）號：	CN110846252B	公開（公告）日：	2022-12-02
發明（設計）人：	蓋曉彤;盧燦華;雷麗萍;馬俊華;姜寧;余清;鄒聰明;夏振遠	申請（專利權）人：	云南省煙草農業科學研究院
主分類號：	C12N1/20	分類號：	C12N1/20;C12N1/02;A24B15/20;C12R1/07
代理公司：	昆明知道專利事務所(特殊普通合伙企業) 53116	代理人：	姜開俠;姜開遠
地址：	650021***	國省代碼：	云南;53
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種高地芽孢桿菌 j45 及其獲取方法應用
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【說明書】：

本發明公開了一種高地芽孢桿菌J45及其獲取方法與應用，所述的高地芽孢桿菌為高地芽胞桿菌（Bacillus altitudinis）J45，已在中國典型培養物保藏中心保藏，其保藏編號為CCTCC No.M2019666。獲取方法包括分離、篩選、純化工序，首先從煙株組織中分離能降解尼古丁的菌株，再用以尼古丁為唯一碳源的NIM培養基篩選，最后在培養基平板上純化即得。菌株的應用包括發酵、接種、降解工序，首先將菌株在30℃下培養48~72h得發酵菌劑，于煙葉調制或制絲過程中，將發酵菌劑按煙草重量的3~5%噴施，保持4~7天的降解時間即可。所述菌株能實現煙草特有亞硝胺的高效定向降解，且抗逆性好，簡便易得，使用方便，具有較高的推廣應用價值。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種高地芽孢桿菌J45及其獲取方法與應用。

背景技術

煙草特有的N-亞硝基類化合物（TSNAs）是一類重要的胺類化合物，其中NNN、NNK、NAB、NAT是煙草和煙氣中主要的TSNAs，而NNK和NNN對嚙齒動物具有強烈的癌物性。減害技術作為國際煙草的研究重點已取得了很多突破，其中主要包括農業技術中的品種選育與栽培技術、烘烤調制技術、生物技術和物理技術等，這些技術的應用可以調控TSNAs的形成量。微生物在TSNAs的形成中起著重要作用，在調制過程中改變微生物活性和數量，也必然會影響TSNAs的累積。在TSNA的兩條形成途徑中都有微生物在起調節作用。因此，針對煙葉調制過程或煙葉制絲過程中，煙葉或煙絲內的水、熱交換特點，分離、選育一株能實現煙草特有亞硝胺堿定向降解且抗逆性好的菌株，同時結合煙葉調制過程或煙葉制絲過程中環境溫、濕度變化的階段性特征，采取適宜的施用方法，對于生產優質低害的煙葉，提高煙葉安全性和綜合品質，降低煙草特有亞硝胺對人體健康及生活環境帶來的危害都具有十分重要的意義。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一株高地芽孢桿菌J45；第二目的在于提供所述的高地芽孢桿菌J45的獲取方法；第三目的在于提供所述的高地芽孢桿菌J45的應用。

本發明的第一目的是這樣實現的，一株高地芽胞桿菌（Bacillus altitudinis），命名為J45，經鑒定為高地芽胞桿菌（Bacillus altitudinis）的一個株系，是從煙株組織中分離得到，已于2019年8月26日保藏于中國典型培養物保藏中心（簡稱CCTCC，地址為：中國，武漢，中國武漢大學保藏中心，郵編430072），其保藏編號為CCTCC No. M2019666。

本發明的第二目的是這樣實現的，包括分離、篩選及純化與驗證工序，具體包括：

A、分離：將煙株組織研磨后用無菌水清洗，進行表面消毒。用無菌剪刀將表面消毒的煙草葉片剪成小段，置于磷酸鉀緩沖液中，用超聲波處理，用紗布過濾除去煙草葉片。濾液經真空抽濾，將菌體收集濾膜上。將濾膜至于無菌水中，超聲波洗脫菌體細胞。離心收集菌體，溶于無菌水中，將獲得的懸濁液用稀釋平板的方法分離能在分離培養基上生長的菌株；

培養條件為：25~30℃，時間40~55h；

分離培養基成分以g/L計為：瓊脂12.0~18.0、K₂HPO₄1.4~1.8、KH₂PO₄0.3~0.5、NaCl 0.08~0.12、MgSO₄?7H₂O 0.1~0.3、CaCl₂0.04~0.06、MnSO₄?H2O 0.001~0.003、CuSO₄?5H₂O 0.0001、ZnSO₄?7H₂O 0.0002、NaMoO₄?2H₂O 0.0002、尼古丁0.8~1.2，pH 6.5~7.5；