[發明專利]提高2C-like細胞的小鼠胚胎干細胞誘導培養液及小鼠胚胎干細胞誘導培養方法

有效

• 申請號: 201911136323.2
• 申請日: 2019-11-19
• 公開（公告）號: CN110804581B
• 公開（公告）日: 2023-02-14
• 發明（設計）人: 吳寶江;包斯琴;王艷秋;李喜和
• 申請（專利權）人: 內蒙古大學
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/073;C12N5/10
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 趙敬

本發明公開了一種提高2C?like細胞的小鼠胚胎干細胞誘導培養液及小鼠胚胎干細胞誘導培養方法，第一步是從小鼠ESCs培養體系中去除胎牛血清，使小鼠ESCs仍保持原有的多能性特征。第二步是利用視黃酸（RA）在不含有胎牛血清的培養液中提高小鼠ESCs中2C?like細胞的比例，結果從對照組的0.2%提高到3.3%。本發明利用特定的誘導方法提高了小鼠ESCs中2C?like細胞比例，并通過實驗手段驗證了小鼠ESCs在不含有胎牛血清的培養液中2C?like基因表達水平和蛋白水平，對哺乳動物全能干細胞研究提供新思路。

技術領域

本發明涉及小鼠胚胎干細胞誘導培養液，尤其是一種提高2C-like細胞的小鼠胚胎干細胞誘導培養液及小鼠胚胎干細胞誘導培養方法。

背景技術

哺乳動物合子基因組激活（ZGA）是胚胎發生的關鍵步驟，發生在小鼠的1-2細胞階段和人類的4-8細胞階段，這一階段對于哺乳動物早期胚胎發育和全能性的形成具有重要意義。

在小鼠ESCs中含有部分（小于1%）異質性細胞，即類似2-細胞期胚胎樣細胞（2C-like細胞）。2C-like細胞不僅可以表達ZGA轉錄本，而且具有與2細胞胚胎相似的表觀遺傳特征。此外，小鼠ESCs中的2C-like細胞在體內發育狀態下可同時貢獻胚胎和胚外組織中。所以這部分2C-like細胞是體外進行全能性干細胞研究的珍貴模型。但是到目前為止還沒有在化學成分明確的培養條件下維持小鼠ESCs中的2C-like狀態細胞的維持與自我更新。因此，有效提高哺乳動物ESCs中2C-like細胞比率是展開后續研究的重中之重。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，提供一種提高2C-like細胞的小鼠胚胎干細胞誘導培養液及小鼠胚胎干細胞誘導培養方法，通過本方法，能夠得到高比例的2C-like細胞。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案包括以下步驟：一種提高2C-like細胞的小鼠胚胎干細胞誘導培養液，每500ml誘導培養液N2B27+2i/LIF+RA組成為：

N2細胞培養添加劑 2-3 ml

B27細胞培養添加劑 4-6 ml

牛血清白蛋白 20-30 mg

非必需氨基酸 4-6 ml

左旋谷氨酰胺 4-6 ml

β巰基乙醇 0.5-2 ml

青霉素鏈霉素 4-5 ml

PD0325901 1.0 mM

CHIR99021 3.0 mM

白血病抑制因子LIF 500-1500 U/ml

視黃酸RA 5-15 mM

基礎培養液 余量

所述基礎培養液為基礎培養液DMEM/F12和基礎培養液Neurobasal，二者體積比為1:1。

優選，每500ml誘導培養液N2B27+2i/LIF+RA組成為：