[發(fā)明專利]提高DNA甲基化的小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液及小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)方法

有效

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• 申請日: 2019-11-19
• 公開（公告）號(hào): CN110791472B
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳寶江;包斯琴;張寶靜;李喜和
• 申請（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/0735
• 分類號(hào): C12N5/0735;C12N5/10
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 趙敬

本發(fā)明公開了一種提高DNA甲基化的小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液及小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，第一步將小鼠2i/L?ESCs用N2B27中添加白血病抑制因子（LIF培養(yǎng)液）進(jìn)行誘導(dǎo)獲得只依賴LIF的小鼠胚胎干細(xì)胞（L?ESCs），并鑒定了其多能性。第二步是將小鼠2i/LIF?ESCs培養(yǎng)體系換成15%胎牛血清中添加白血病抑制因子的培養(yǎng)液(S/L培養(yǎng)液)，培養(yǎng)5天后，再替換成LIF培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，高效率得到L?ESCs。更換S/L培養(yǎng)液的主要目的是為了提高小鼠ESCs的DNA甲基化水平，這樣可有效提高LIF依賴性ESCs的重編程效率。本發(fā)明首先誘導(dǎo)了只依賴LIF的小鼠ESCs，并鑒定了其特性；其次利用特定的誘導(dǎo)方法提高了LIF依賴性小鼠ESCs重編程效率，對(duì)哺乳動(dòng)物多能干細(xì)胞體外培養(yǎng)提供新思路。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液，尤其是涉及一種提高DNA甲基化的小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液及小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

小鼠胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell ，ESCs)是由著床前胚胎分離而來的多能性細(xì)胞，在保持多向分化能力的同時(shí)，還可以無限地自我更新。在不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的小鼠ESCs表現(xiàn)出不同的DNA甲基化水平。培養(yǎng)于NAB27中添加PD0325901，CHIR99021和白血病抑制因子（LIF）的小鼠2i/L-ESCs表現(xiàn)出DNA低甲基化水平，而培養(yǎng)于15%胎牛血清中添加白血病抑制因子（LIF）的小鼠S/L-ESCs表現(xiàn)出DNA高甲基化水平。此外，小鼠胚胎干細(xì)胞的DNA甲基化水平在這兩種培養(yǎng)液中是可逆的。近年來有學(xué)者提出，Mek1/2的長期抑制會(huì)通過下調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶及其輔因子，損害小鼠ESCs的基因組完整性和DNA甲基化水平，從而影響體內(nèi)發(fā)育潛力。這說明DNA甲基化在小鼠ESCs的多能性維持起重要的作用。因此，揭示DNA甲基化水平對(duì)哺乳動(dòng)物ESCs的多能性維持和分化過程中的作用具有重要的科學(xué)意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種提高DNA甲基化的小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液及小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，可以顯著提高LIF依賴性小鼠胚胎干細(xì)胞重編程效率。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括以下步驟：一種提高DNA甲基化的小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液，每500ml LIF培養(yǎng)液的組成：

N2細(xì)胞培養(yǎng)添加劑 2-3 ml

B27細(xì)胞培養(yǎng)添加劑 4-6 ml

牛血清白蛋白 20-30 mg

非必需氨基酸 4-6 ml

左旋谷氨酰胺 4-6 ml

β巰基乙醇 0.5-2 ml

青霉素鏈霉素 4-5 ml

白血病抑制因子LIF 500-1500 U/ml

基礎(chǔ)培養(yǎng)液 余量

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液DMEM/F12和基礎(chǔ)培養(yǎng)液Neurobasal，二者體積比為1:1。

優(yōu)選，每500ml LIF培養(yǎng)液的組成：

基礎(chǔ)培養(yǎng)液DMEM/F12 238.0 ml

基礎(chǔ)培養(yǎng)液Neurobasal 238.0 ml

N2細(xì)胞培養(yǎng)添加劑 2.5 ml