[發明專利]一種合成紫杉二烯的植物表達載體、菌株DZGGPPSTS和盾葉薯蕷及其制備方法

在審

• 申請號: 201911131976.1
• 申請日: 2019-11-19
• 公開（公告）號: CN110904148A
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發明（設計）人: 陳永勤;沈君豪;楊之帆
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/54;C12N15/60;C12N1/21;A01H5/00;A01H4/00;A01H6/00
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 江慧

1.一種合成紫杉二烯的植物表達載體，其特征在于，所述載體包含紅豆杉牻牛兒基牻牛兒焦磷酸合酶基因GGPPS的表達盒和紅豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表達盒；

所述紅豆杉牻牛兒基焦磷酸合酶基因GGPPS的表達盒為CaMV35S-GGPPS-Tnos，包括：花椰菜花葉病毒35S基因啟動子序列CaMV35S、核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的紅豆杉牻牛兒基焦磷酸合酶基因GGPPS和農桿菌胭脂堿合酶基因終止子序列Tnos；

所述紅豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表達盒為CaMV35S2-TS-CaMV 3'UTR包括：含重復增強子的花椰菜花葉病毒35S基因啟動子序列CaMV35S2、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的紅豆杉紫杉二烯合酶基因TS和花椰菜花葉病毒35S基因的3'非翻譯序列CaMV 3'UTR。

2.如權利要求1所述的一種合成紫杉二烯的植物表達載體，其特征在于，所述載體為pCAMBIA-GGPPS-TS，為在植物雙元載體pCAMBIA-Pnos-PNN上克隆有所述紅豆杉牻牛兒基焦磷酸合酶基因GGPPS的表達盒CaMV35S-GGPPS-Tnos和所述紅豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表達盒CaMV35S2-TS-CaMV 3'UTR。

3.一種菌株DZGGPPSTS，其特征在于，該菌株由權利要求2所述的pCAMBIA-GGPPS-TS載體轉入根癌農桿菌中得到，且該菌株的保藏編號為CCTCC NO：M2019685。

4.一種合成紫杉二烯的轉基因盾葉薯蕷植株，其特征在于，將權利要求1-2所述的紅豆杉牻牛兒基焦磷酸合酶基因GGPPS的表達盒CaMV35S-GGPPS-Tnos和所述紅豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表達盒CaMV35S2-TS-CaMV 3'UTR同時整合到盾葉薯蕷基因組中。

5.一種權利要求4所述的表達紫杉二烯的轉基因盾葉薯蕷植株的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

步驟1、將權利要求3所得基因工程菌菌株DZGGPPSTS轉化盾葉薯蕷細胞，并通過植物組織培養技術獲得再生植株；

步驟2、對再生植株進行鑒定，篩選出轉基因盾葉薯蕷植株。

6.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1中所述基因工程菌菌株DZGGPPSTS轉化盾葉薯蕷細胞和獲得再生植株的具體步驟為：

S1、在含卡那霉素和利福平的YEP液體培養基中培養基因工程菌菌株DZGGPPSTS后，離心收集菌體，用液體培養基重新懸浮得到的菌液備用；

S2、盾葉薯蕷幼莖消毒后切成小段，接種在愈傷組織誘導培養基上誘導愈傷組織并在愈傷組織增殖培養基上進行增殖；將增殖后的愈傷組織塊切成薄片，浸泡在步驟S1制備得到的菌液中；

S3、將所述愈傷組織塊取出吸干菌液后，轉移到共培養基上培養；

S4、共培養結束后，將愈傷組織塊轉移到選擇再生培養基上培養誘導不定芽；

S5、不定芽分別繼代在選擇再生培養基上進行增殖，每個不定芽增殖所形成的芽構成一個無性系；

S6、將不定芽轉到生根培養基上誘導生根、形成完整的轉基因植株。

7.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述S1中卡那霉素和利福平的濃度均為50mg/L；所述懸浮用的液體培養基為1/2MS培養基+20g/L蔗糖+1mg/L BA+0.5mg/L NAA+200μM乙酰丁香酮。

8.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述S2中愈傷組織誘導培養基為1/2MS培養基+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂+2mg/L BA+1mg/L NAA；所述愈傷組織增殖培養基為1/2MS培養基+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂+1mg/L BA+0.5mg/L NAA；培養條件為溫度25±1℃、光照強度30-45μmol m^-2s^-1、光周期16h。