[發(fā)明專利]一種合成紫杉二烯的植物表達(dá)載體、菌株DZGGPPSTS和盾葉薯蕷及其制備方法

在審

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• 申請日: 2019-11-19
• 公開（公告）號: CN110904148A
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳永勤;沈君豪;楊之帆
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北大學(xué)
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/54;C12N15/60;C12N1/21;A01H5/00;A01H4/00;A01H6/00
• 代理公司: 武漢智嘉聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 42231
• 代理人: 江慧

本發(fā)明提供了一種合成紫杉二烯的植物表達(dá)載體、菌株DZGGPPSTS和盾葉薯蕷及其制備方法。該載體包含紅豆杉牻牛兒基焦磷酸合酶基因GGPPS表達(dá)盒CaMV35S?GGPPS?Tnos以及紅豆杉紫杉二烯合酶基因TS表達(dá)盒CaMV35S2?TS?CaMV 3'UTR。菌株DZGGPPSTS由所述載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中得到且保藏編號為CCTCC NO：M2019685；將所述載體通過菌株DZGGPPSTS介導(dǎo)整合到盾葉薯蕷基因組中并通過再生得到能合成紫杉二烯的轉(zhuǎn)基因植株；本發(fā)明同時超表達(dá)GGPPS基因和超表達(dá)TS基因，以盾葉薯蕷作為受體植物，得到合成紫杉二烯能力強的轉(zhuǎn)基因植株。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種合成紫杉二烯的植物表達(dá)載體、菌株DZGGPPSTS和盾葉薯蕷及其制備方法。

背景技術(shù)

來源于紅豆杉的紫杉醇是迄今最重要的植物抗癌藥物，從上世紀(jì)九十年代以來一直是臨床上治療乳腺癌、子宮癌、肺癌和頭頸癌的一線藥物，對其它腫瘤的治療還在研究中。此外，其它紫杉烷抗癌藥物(如Taxotere、Abraxane)也相繼被開發(fā)并在臨床上應(yīng)用，紫杉烷類抗腫瘤藥物研究成為藥物研發(fā)的熱點之一。發(fā)現(xiàn)新紫杉烷是新藥研發(fā)的關(guān)鍵。世界上紅豆杉資源有限，共11種，我國有4種和1變種，都生長緩慢、紫杉醇和紫杉烷含量很低，一般為干重的0.01％左右，甚至更低。經(jīng)過20多年的研究，紅豆杉中的紫杉烷幾乎被分離殆盡，發(fā)現(xiàn)新紫杉烷越來越難，即使有，也會因含量太低而不能進(jìn)行藥效學(xué)研究。開辟新的紫杉烷資源對于紫杉烷類藥物研究具有重要意義。

紫杉二烯是合成紫杉醇和紫杉烷的共同前體物質(zhì)，利用植物基因工程技術(shù)可以使非紅豆杉屬植物合成紫杉二烯，這為開辟新的紫杉烷資源帶來了希望。但已報道的轉(zhuǎn)基因植物中紫杉二烯含量都很低，如擬南芥為0.025mg/kg(干重)、煙草為27mg/kg(干重)、人參為16mg/kg(干重)，不利于發(fā)現(xiàn)和分離新紫杉烷。因此，如何培育出合成紫杉二烯能力強的轉(zhuǎn)基因植物成為亟待解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，提供了一種合成紫杉二烯的植物表達(dá)載體、菌株DZGGPPSTS和盾葉薯蕷及其制備方法。本發(fā)明采用同時超表達(dá)GGPPS基因以促進(jìn)紫杉二烯的底物GGPP合成和超表達(dá)TS基因以促進(jìn)GGPP轉(zhuǎn)化為紫杉二烯的策略，以盾葉薯蕷作為受體植物，所得到的轉(zhuǎn)基因盾葉薯蕷植株中紫杉二烯含量大都顯著高于已報道的轉(zhuǎn)基因擬南芥、煙草和人參，有利于今后進(jìn)一步系統(tǒng)分析轉(zhuǎn)基因植株中的紫杉烷成份。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

本發(fā)明的目的之一，在于提供一種合成紫杉二烯的植物表達(dá)載體，所述載體包含紅豆杉牻牛兒基牻牛兒焦磷酸合酶基因GGPPS的表達(dá)盒和紅豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表達(dá)盒；

所述紅豆杉牻牛兒基焦磷酸合酶基因GGPPS的表達(dá)盒為CaMV35S-GGPPS-Tnos，包括：花椰菜花葉病毒35S基因啟動子序列CaMV35S，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的紅豆杉牻牛兒基焦磷酸合酶基因GGPPS，和農(nóng)桿菌胭脂堿合酶基因終止子序列Tnos；

所述紅豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表達(dá)盒為CaMV35S2-TS-CaMV 3'UTR包括：含重復(fù)增強子的花椰菜花葉病毒35S基因啟動子序列CaMV35S2、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的紅豆杉紫杉二烯合酶基因TS和花椰菜花葉病毒35S基因的3'非翻譯序列CaMV 3'UTR。

具體地，所述載體為pCAMBIA-GGPPS-TS，所述載體為在植物雙元載體pCAMBIA-Pnos-PNN上克隆有所述紅豆杉牻牛兒基焦磷酸合酶基因GGPPS的表達(dá)盒CaMV35S-GGPPS-Tnos和所述紅豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表達(dá)盒CaMV35S2-TS-CaMV 3'UTR。