[發明專利]一種與大黃魚抗鰻弧菌關聯的SNP位點、其篩選方法和應用

在審

• 申請號: 201911127345.2
• 申請日: 2019-11-18
• 公開（公告）號: CN110699466A
• 公開（公告）日: 2020-01-17
• 發明（設計）人: 孫明潔;鮑寶龍;龔小玲
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 31227 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司
• 代理人: 周一新

本發明屬于魚類分子標記篩選技術領域，具體公開了一種與大黃魚抗鰻弧菌關聯的SNP位點、其篩選方法和應用，SNP位點位于大黃魚如SEQ ID NO:1所示的IL?6R基因cDNA序列上，且其1021位堿基處存在一個G或C的等位基因突變；經提取鰻弧菌感染大黃魚幼魚的RNA并反轉錄成cDNA，設計如SEQ ID NO:2所述的正向引物和如SEQ ID NO:3所示的反向引物，以cDNA為模板進行PCR擴增反應，對目的條帶清晰無雜帶的PCR產物進行測序篩選得到。本發明中與大黃魚抗鰻弧菌相關的SNP位點可用于抗鰻弧菌大黃魚遺傳育種，為大黃魚的抗菌選育工作提供新思路。

技術領域

本發明屬于魚類分子標記篩選技術領域，涉及一種與大黃魚抗鰻弧菌關聯的單核苷酸多態性(SNP)分子標記，特別涉及一種位于大黃魚IL-6R基因上與抗鰻弧菌關聯的SNP位點、其篩選方法和應用。

背景技術

大黃魚(Larimichthys crocea)俗稱黃魚、黃姑魚、黃花魚，鱸形目、石首魚科、黃魚屬。大黃魚體形長，側扁；頭大且尖銳；尾柄細而長；鱗片小，身體側的鱗片通常有金黃色的腺體；側線完全，前部略微彎曲，直魚身背部背面和上部呈黃棕色，下部和腹面呈金黃色。大黃魚是淺海近底層魚類，不喜強光，肉食性。它們是浙江、福建、廣東等地區網箱養殖的主要經濟魚類。

鰻弧菌(Vibro anguillarum)可以感染大黃魚等海洋經濟魚類患病。被鰻弧菌感染的大黃魚等海產品，會出現體表發黑，肌肉組織紅腫充血，鰭部潰爛，鰭條、鰭的基部和肱骨下部充血發紅，肛門紅腫等癥狀，解剖感染的病魚發現腸道發黑腸粘膜脫落，腹腔內出水，腎臟出血、肝臟壞死等癥狀。

傳統的遺傳育種要選育多代，速度慢、成功率低。從遺傳角度出發，SNP分子標記不僅可以評估大黃魚遺傳多樣性，還為大黃魚的抗鰻弧菌選育工作提供直接的遺傳標記，目前還沒有與大黃魚抗鰻弧菌相關的SNP位點的相關報道。

發明內容

本發明針對鰻弧菌感染大黃魚患弧菌病，提供一種位于大黃魚IL-6R基因上與抗鰻弧菌關聯的SNP位點，確定大黃魚免疫相關基因的SNP位點與抗鰻弧菌關聯，為大黃魚抗鰻弧菌的選育提供分子標記。

本發明中，與大黃魚抗鰻弧菌相關的SNP位點，位于大黃魚如SEQ ID NO:1所示的IL-6R基因cDNA序列上，其1021位堿基處存在一個G或C的等位基因突變，且該突變引起第341位氨基酸由纈氨酸Val(GUG)突變為亮氨酸Leu(CUG)。

本發明還提供了上述與大黃魚抗鰻弧菌相關的SNP位點的篩選方法，包括以下步驟：

(ⅰ)用鰻弧菌感染大黃魚幼魚后，提取其RNA并反轉錄成cDNA，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示；

(ⅱ)設計引物對如SEQ ID NO:2所述的正向引物和如SEQ ID NO:3所示的反向引物，以cDNA為模板進行PCR擴增反應；

(ⅲ)經瓊脂糖凝膠檢測，對目的條帶清晰無雜帶的PCR產物進行測序，篩選得到上述SNP位點。

步驟(ⅱ)中，所述PCR擴增反應體系為：正向引物(10uM)和反向引物(10uM)各1uL、cDNA模板1uL和無菌水9.5uL；和/或

所述PCR擴增反應的程序依次為：95℃預變性5min、94℃變性30s、64℃退火30s、72℃延伸30s(45個循環)和72℃延伸10min。

本發明還提供了上述與大黃魚抗鰻弧菌相關的SNP位點在抗鰻弧菌大黃魚遺傳育種上的用途。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：