[發(fā)明專利]Fc融合蛋白的純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911124845.0
• 申請日: 2019-11-18
• 公開（公告）號: CN110724204B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉云鵬;蘆迪;劉恒嘉
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東菲鵬制藥股份有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C07K1/14;C12P21/02
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 周文波

本發(fā)明公開了一種Fc融合蛋白的純化方法，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開的Fc融合蛋白的純化方法包括將含有Fc融合蛋白的洗脫液的pH值調(diào)節(jié)至4.9?5.1。本發(fā)明提供的純化方法可以顯著降低產(chǎn)物中的高聚集體Fc融合蛋白，提高Fc融合蛋白的純度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及Fc融合蛋白的純化方法。

背景技術(shù)

白細(xì)胞介素-10（IL-10）細(xì)胞因子，由Mosmannand等于1989年首次報道，是一種多效細(xì)胞因子，對免疫系統(tǒng)具有雙向調(diào)節(jié)作用，其通過T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞調(diào)節(jié)多種免疫應(yīng)答。一方面，IL-10可通過抑制活化的單核細(xì)胞和活化的巨噬細(xì)胞中IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-8，TNF-α，GM-CSF和G-CSF的表達(dá)來抑制主要與炎癥相關(guān)的免疫應(yīng)答；另一方面，John B. Mumm等發(fā)現(xiàn)IL-10可誘導(dǎo)并刺激腫瘤浸潤性CD8⁺T分泌細(xì)胞毒細(xì)胞因子γ干擾素（IFN-γ），并進(jìn)一步介導(dǎo)細(xì)胞毒物質(zhì)顆粒酶B（Granzyme B）和穿孔素（perfolin）等的產(chǎn)生，從而抑制并殺傷腫瘤細(xì)胞，表現(xiàn)出相應(yīng)的免疫刺激作用。ARMO BIOSCIENCES, INC.報道了其聚乙二醇化IL-10(PEG-IL-10，AM0010)劑量依賴性抗腫瘤活性。

鑒于IL-10相關(guān)疾病，病癥和病癥的患病率以及嚴(yán)重程度，調(diào)節(jié)IL-10功能方面的IL-10相關(guān)藥物具有巨大的治療價值。

單純的IL-10分子分子量僅為37KDa左右，很容易在人體內(nèi)被腎臟等器官代謝，造成其極短的體內(nèi)半衰期（2~6小時），極大地影響了其療效。因此有必要通過一定的手段延長其體內(nèi)半衰期。

Fc融合蛋白（Fc-fusion protein）正是一種延長功能蛋白在體內(nèi)半衰期的有效方式。

免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）分子主要基于其可結(jié)晶片段（Crystallizable fragment，F(xiàn)c）以pH依賴的方式與新生兒Fc受體（neonatal Fcreceptor，F(xiàn)cRn）結(jié)合從而避免被細(xì)胞核內(nèi)體降解，延長單抗的半衰期，這對于改進(jìn)給藥頻率，病人的依從性以及成本都有著重要意義。

而Fc融合蛋白通過DNA重組技術(shù)將IgG Fc基因與目標(biāo)蛋白基因重組后，得到的表達(dá)產(chǎn)物與重組前目標(biāo)蛋白相比，其半衰期可被顯著延長，同時，由于Fc片段的引入，使得目標(biāo)蛋白的純化工藝可以基于Protein A、G等特異性強的親和層析技術(shù)而被大大簡化。

采用ProteinA、G類型的高特異性親和層析技術(shù)所收獲的Fc融合蛋白易于形成聚集體，如果直接施用于臨床，可能將造成臨床上更嚴(yán)重的免疫原性，對于生物類重組蛋白藥物來講這是不允許的。

另外的層析純化方法，如陰、陽離子交換層析，凝膠過濾層析，疏水相互作用層析雖然能在一定程度上去除聚集體。但是使用這類層析純化方法往往涉及代價高昂的層析設(shè)備、層析柱以及層析填料，硬件配置要求較高；同時不可避免地?fù)p失部分目標(biāo)物，造成低于預(yù)期的目標(biāo)物收率，給目標(biāo)物生產(chǎn)帶來困難。其次，基于層析技術(shù)的工藝開發(fā)過程也極其復(fù)雜、繁瑣和費時。

鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種Fc融合蛋白的純化方法，以克服上述問題。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

第一方面，本發(fā)明實施例提供一種Fc融合蛋白的純化方法，其包括：將含有Fc融合蛋白的洗脫液的pH值調(diào)節(jié)至4.9-5.1。

本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用親和層析技術(shù)純化Fc融合蛋白中，在洗脫過程中不可避免地涉及到一些極端洗脫條件，例如低pH（一般是pH3.0~3.5，甚至更低如pH2.0~2.7），因此，對于pH等穩(wěn)定性較差的Fc融合蛋白來說，其往往更易于形成聚集體。