[發明專利]一種殺蟲球孢白僵菌工程菌構建方法

有效

• 申請號: 201911124752.8
• 申請日: 2019-11-18
• 公開（公告）號: CN110669777B
• 公開（公告）日: 2023-09-12
• 發明（設計）人: 李同祥;孫會剛;田林;湯薇;黃天姿;董玉瑋;李文;王春艷;高兆建;王陶
• 申請（專利權）人: 徐州工程學院
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/80
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 張婷婷

1.一種殺蟲球孢白僵菌工程菌構建方法，其特征在于，具體步驟如下：

第一步、設計擴增AaIT基因引物，引物設計時分別引入BamHI和EcoRI酶切位點，利用設計的引物從pUC57-AaIT中擴增AaIT基因序列；

第二步、AaIT基因的PCR擴增產物經純化后，用BamHI和EcoRI酶進行酶切，同時用BamHI和EcoRI酶酶切pbarGPEl；分別進行純化后，建立連接反應體系連接AaIT基因和pbarGPEl；

第三步、連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞并進行驗證，構建成pbarGPEl-AaIT載體；

第四步、設計含Not1酶切位點的引物，從pbarGPEl-AaIT載體擴增出GpdA-AaIT-TrpC表達盒；

第五步、用Not1酶酶切pGPS3Ben-bbchit1，并進行去磷酸化處理；

第六步、將第五步得到的去磷酸化處理的pGPS3Ben-bbchit1和GpdA-AaIT-TrpC表達盒連接，獲得pGPS3Ben-bbchit1-AaIT表達載體，轉化大腸桿菌，提取質粒；

第七步、第六步提取的質粒采用凍融法導入根癌農桿菌感受態細胞中，進行抗性篩選，獲取根癌農桿菌陽性菌落；

第八步、球孢白僵菌孢子懸液和含pGPS3Ben-bbchit1-AaIT載體的根癌農桿菌菌液混合，經在固體IM培養基上共培養和CPZ選擇培養基上多次篩選獲得轉化工程菌株。

2.根據權利要求1所述的一種殺蟲球孢白僵菌工程菌構建方法，其特征在于：所述第一步中擴增AaIT基因引物分別引入BamHI和EcoR1酶切位點，引物序列為：AaIT-F-BamHI如5'-SEQ?ID?NO：1-3'所示；AaIT-R-EcoRI如5'-SEQ?ID?NO：2-3'所示。

3.根據權利要求1所述的一種殺蟲球孢白僵菌工程菌構建方法，其特征在于：所述第二步中所用pbarGPEl載體含有BamHI和EcoRI酶切位點。

4.根據權利要求1所述的一種殺蟲球孢白僵菌工程菌構建方法，其特征在于，所述第二步中連接反應體系中AaIT和pbarGPEl的濃度摩爾比為3:1。

5.根據權利要求1所述的一種殺蟲球孢白僵菌工程菌構建方法，其特征在于：所述第三步中所用大腸桿菌感受態為DH-5α。

6.根據權利要求1所述的一種殺蟲球孢白僵菌工程菌構建方法，其特征在于：所述第四步中從pbarGPEl-AaIT載體擴增GpdA-AaIT-TrpC所用的正反引物序列均含Not1酶切位點。

7.根據權利要求1所述的一種殺蟲球孢白僵菌工程菌構建方法，其特征在于：所述第七步中懸菌體是涂布在含氨芐和苯菌靈的YEB平板上，其中氨芐和苯菌靈濃度分別為12.0μg/m和8.0μg/mL。

8.根據權利要求1所述的一種殺蟲球孢白僵菌工程菌構建方法，其特征在于：所述第八步中固體IM培養基上含：NaCl以w/v記為0.03％，MgS0₄.7H₂以w/v記為00.03％，K₂HP0₄以w/v記為0.03％，甘油以v/v記為0.5％，MES?0.04mmo1/L，還包括3.5mmol/L葡萄糖和350mmol/L乙酰丁香酮。